Potencial de la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con analizadores de triple cuadrupolo y de tiempo de vuelo para la elucidación, cuantificación y confirmación de plaguicidas y productos de transformación en muestras ambientales

Abstract

Dentro de la problemática ambiental, los plaguicidas son, posiblemente, una de las<br/>familias de contaminantes que más preocupan en la actualidad, debido a su toxicidad y<br/>elevado uso en todo el planeta, así como a la posibilidad de contaminación de distintos tipos de muestras (suelos, aguas, aire, productos alimenticios). El elevado número de plaguicidas actualmente en uso, junto con la gran variabilidad que presentan en cuanto a sus propiedades físico-químicas, dificulta de forma considerable su análisis a nivel de residuos. Aunque se han realizado numerosos estudios ambientales, la mayoría de programas de control de estos contaminantes, tanto en el medio ambiente, como en alimentos o seres vivos expuestos, se centran en tan sólo unos pocos productos (normalmente el plaguicida inalterado), a pesar de que se conocen algunos productos de transformación/metabolitos relativamente estables, persistentes y tóxicos.<br/>Esta carencia de información generalizada sobre la presencia de productos de transformación (TPs) en el medio ambiente es debida, principalmente, a la falta de metodología analítica. Así pues, parece necesario generar información sobre las rutas de degradación/transformación de estos compuestos, desarrollar metodología analítica que permita determinar sus niveles en el medio ambiente, así como evaluar su impacto en el<br/>mismo, especialmente en aguas superficiales y subterráneas. Para este fin, es necesario utilizar técnicas modernas y poderosas, en especial la espectrometría de masas, que en los últimos años se ha mostrado como una técnica indispensable en muchas áreas de la Química Analítica.<br/>En esta Tesis se ha explorado el potencial analítico y las aplicaciones del acoplamiento instrumental cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) e híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) en la determinación de plaguicidas, principalmente en el campo medioambiental, poniendo especial énfasis en los aspectos cualitativos, es decir, en la correcta confirmación de la identidad de los compuestos detectados, siguiendo los criterios de las actuales guías europeas.<br/>El trabajo ha sido estructurado en cuatro partes. En primer lugar, se ha explorado el<br/>potencial del acoplamiento LC-QTOF MS en el análisis cualitativo. La versatilidad de la LC, junto con la elevada exactitud de masa del QTOF y la posibilidad de obtener espectros de iones producto con masa exacta, ha permitido la detección, identificación y elucidación de TPs/metabolitos de plaguicidas seleccionados. Inicialmente, se seleccionó como caso de estudio una familia de herbicidas ampliamente utilizada (triazinas). En vista del éxito de los resultados obtenidos, se decidió ampliar el trabajo a otros plaguicidas aplicados en la Comunidad Valenciana, como por ejemplo, bromacilo, diuron o diazinon. En el caso del diazinon, además, se llevaron a cabo estudios in vitro (con microsomas hepáticos humanos) e in vivo (con ratas), con el fin de elucidar sus principales metabolitos, demostrando así la gran capacidad analítica de esta técnica tanto en el campo ambiental como biológico.<br/>Adicionalmente, la metodología desarrollada fue ligeramente modificada para el estudio de compuestos desconocidos (non-target), tras la inyección directa de muestras acuosas de diferentes orígenes. La aplicación de esta metodología permitió la identificación de varios contaminantes en muestras de agua de la Comunidad Valenciana.<br/>En segundo lugar, se ha estudiado el potencial del acoplamiento LC-QqQ MS para la determinación cuantitativa de residuos de plaguicidas y de sus TPs en muestras ambientales. Se han puesto a punto dos métodos basados en SPE-LC-MS/MS: el primero de ellos para la determinación multirresiduo de plaguicidas seleccionados y de sus TPs en muestras de agua, y el segundo para la determinación de compuestos altamente polares como el glifosato, su producto de transformación (AMPA) y el glufosinato, ante la imposibilidad de incluirlos en el método multirresiduo anteriormente descrito. Los métodos fueron optimizados y validados tanto en muestras de agua subterránea como superficial siguiendo el "espíritu" de las Buenas Prácticas de Laboratorio, según los criterios de las guías SANCO de la Union Europea, estableciendo los parámetros de linealidad, especificidad, exactitud y precisión. En el caso del glifosato y AMPA, el método fue además validado en muestras de suelo. Posteriormente, la metodología se aplicó al análisis de muestras reales, con el fin de obtener información sobre el nivel de contaminación de las aguas de la Comunidad Valenciana.<br/>En tercer lugar, se ha comparado el potencial de los distintos equipos instrumentales<br/>utilizados en cuanto a su poder de confirmación de plaguicidas y TPs en muestras reales de agua, de acuerdo con las actuales guías europeas (2002/657/EC). Se han mostrado ejemplos ilustrativos de muestras reales de agua, sobre las que se han detectado diferentes plaguicidas y TPs, y se han discutido las posibilidades de reportar falsos positivos o falsos negativos. En general, se ha demostrado que el triple cuadrupolo puede utilizarse de manera eficiente para la confirmación de muestras positivas siempre y cuando se adquieran varias transiciones MS/MS. El uso de 2 transiciones SRM (Selected Reaction Monitoring) es una alternativa válida, siempre que se realice una selección adecuada considerando su especificidad. Por lo que se refiere al QTOF, su modo de operar permite monitorizar todos los iones producto simultáneamente sin necesidad de preseleccionarlos previamente, lo que, unido a las medidas de masa exacta, le proporciona un extraordinario potencial con fines identificativos. El QTOF, sin embargo, presenta una limitación respecto al QqQ en modo SRM debido a su menor sensibilidad, lo que puede imposibilitar la confirmación de ciertos positivos a bajas concentraciones.<br/>Finalmente, se han efectuado dos revisiones científicas en las que se muestran diferentes estrategias para afrontar la determinación de plaguicidas por LC-MS/MS. La estrategia a seguir dependerá del objetivo perseguido y del instrumento disponible, ya que los requisitos del método a utilizar diferirán dependiendo de si se quiere detectar, cuantificar o confirmar la presencia de un posible residuo. A modo de resumen, el triple cuadrupolo se considera muy adecuado para la cuantificación y el cribado (screening) de compuestos predefinidos (target analytes). Esta aproximación presenta, sin embargo, una limitación debido a la necesidad de preseleccionar los compuestos objeto de estudio. En cuanto a la confirmación, el uso de transiciones no específicas, como por ejemplo pérdidas de agua, puede resultar esporádicamente en falsos positivos incluso adquiriendo dos transiciones, ya que aumenta la probabilidad de encontrar interferentes que compartan la misma transición. Por otra parte, también podrían resultar falsos negativos en el caso de que una de las transiciones fuera compartida por un interferente, ya que afectaría a la relación de abundancias iónicas experimental. Esta posibilidad aumenta cuando el analito se encuentra a niveles de concentración del orden de sub-ppb. Por este motivo, se considera que la mejor aproximación para una confirmación segura de residuos es la adquisición del mayor número posible de transiciones disponibles.<br/>El QTOF en cambio, debido a su elevada sensibilidad en modo scan y a la posibilidad de realizar experiencias en modo MS y MS/MS con medidas de masa exacta, es ideal para la búsqueda de compuestos desconocidos (sin necesidad de ser preseleccionados) y para la elucidación estructural. En cuanto a la confirmación de positivos, el QTOF puede considerarse como la herramienta ideal que permite la identificación inequívoca del analito. Sin embargo, existe la posibilidad de reportar falsos negativos si se encuentra presente en la muestra algún interferente isobárico que coeluya con el analito. En este caso, la mejor opción sería mejorar la separación cromatográfica, lo cual demuestra que ésta juega un papel fundamental en los métodos analíticos, incluso cuando va acoplada a técnicas poderosas de medida como MS/MS con analizadores de QTOF. <br/>En esta Tesis se ha establecido una metodología de trabajo moderna, altamente especializada y con herramientas analíticas poderosas, que podría aplicarse a otros campos de interés relacionados con el impacto de contaminantes orgánicos sobre el medio ambiente, alimentos, y, en definitiva, sobre los seres vivos.