Kinetic and proteomic identification of protease inhibitors in marine invertebrates. Characterization of a carboxypeptidase inhibitor isolated from the mollusc nerita versicolor

Author

Covaleda Cortés, Giovanny

Director

Avilés, Francesc X. (Francesc Xavier)

Chávez Planes, María de los Ángeles

Date of defense

2012-10-23

Pages

282 p.



Department/Institute

Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Biologia Animal, de Biologia Vegetal i d'Ecologia

Abstract

El presente trabajo describe la identificación cinética de actividad inhibidora de carboxipeptidasa A (CPA), carboxipeptidasa B (CPB), pepsina, papaína, tripsina y subtilisina en 30 extractos de invertebrados marinos del Caribe. Los resultados cualitativos mostraron catorce extractos con actividad inhibidora de tripsina, nueve extractos con actividad inhibidora de CPA, CPB, papaína y subtilisina, y sólo cuatro extractos con actividad inhibidora de pepsina. Los extractos más prometedores fueron seleccionados en términos de actividad inhibidora específica, relación dosis-respuesta, IC50 y biodisponibilidad de la especie. Por otra parte, Intensity Fading MALDI-TOF MS, un método proteómico utilizado en este trabajo para completar la estrategia de identificación de inhibidores de proteasas en extractos marinos, resultó ser muy útil para detectar moléculas, capaces de interactuar selectivamente con enzimas diana inmovilizadas, como fue el caso de N. versicolor frente a CPA y CPB, H. carunculata con pepsina, S. helianthus con papaína, N. peloronta y S. helianthus con tripsina y L. isodyctialis con subtilisina. Este trabajo también describe la aplicación de la fragmentación mediante MALDI-TOF MS en una estrategia de caracterización utilizando moléculas resueltas obtenidas en la fracción de elución de IF MALDI-TOF MS. Dos ejemplos son descritos: el primero es con el pico mayoritario obtenido de la interacción entre H. carunculata y pepsina-NHS Sepharose™, fragmentado mediante CID MALDI-TOF/TOF y analizado mediante secuenciación de novo. Otro ejemplo emplea la fragmentación ISD MALDI-TOF MS con la fracción de elución de S. helianthus y tripsina-glioxal Sepharose®. Otro objetivo de este trabajo fue la purificación y caracterización estructural – funcional de NVCI, un inhibidor proteico de carboxipeptidasa aislado del caracol marino N. versicolor. La combinación de técnicas tales como la degradación automatizada de Edman y secuenciación de novo por MALDI-TOF MS permitió el establecimiento de su estructura primaria. La síntesis y clonación del ADNc de NVCI permitió confirmar su secuencia de aminoácido. NVCI es una proteína con 53 residuos de aminoácidos, una masa molecular de 5944 Da y tres puentes disulfuro (código UniProt: P86912). NVCI recombinante fue producido en Pichia pastoris con un alto rendimiento en términos de proteína y actividad. NvCI natural y recombinante mostraron valores de Ki en el intervalo picomolar frente a carboxipeptidasas, tales como bCPA1, hCPA1 y hCPA4. Otros valores de Ki estuvieron en el orden de 1x10-10 M (hCPB1, pCPB1, hTAFI y bTAFI), con excepción de hCPA2 (1x10-9 M). NVCI es un inhibidor competitivo reversible de unión fuerte que representa el inhibidor de carboxipeptidasa más potente de naturaleza proteica descrito actualmente. La estructura de rayos X del complejo NvCI-hCPA4 (código PDB: 4A94) mostró que el inhibidor está formado básicamente por dos hojas β centrales antiparalelas conectadas por tres bucles principales. Las hojas β son estabilizadas mediante tres puentes disulfuro, un pequeño núcleo hidrofóbico situado junto al extremo C-terminal de NvCI y algunos residuos hidrófobos voluminosos expuestos al disolvente. NVCI tiene un área total de contacto de 1875,1 Å2 con la hCPA4. El mecanismo de inhibición de NVCI se debe a una interacción competitiva con el sitio activo de la carboxipeptidasa, por oclusión de los subsitios S1', S1, S2 y S3, tal como se ha observado para la mayoría de los inhibidores proteicos de carboxipeptidasa reportados anteriormente. Estos sitios están ocupados por el extremo C-terminal de NVCI y constituyen la región de contacto primaria del inhibidor. La zona de contacto secundaria está más extendida y cubre casi una cara del inhibidor. Los valores de Ki inferiores observados para NVCI en comparación con otros inhibidores se pueden atribuir tanto a las regiones de interacción "primaria" y "secundaria", que crean una interfaz extendida con la carboxipeptidasa que minimiza la liberación de producto de la reacción catalítica.


The present work described the kinetic identification of carboxypeptidase A (CPA), carboxypeptidase B (CPB), pepsin, papain, trypsin and subtilisin inhibitory activities in 30 Caribbean marine invertebrate extracts. The qualitative results showed fourteen extracts with trypsin inhibitory activity, nine extracts with CPA, CPB, papain and subtilisin inhibitory activities, whilst only four extracts with pepsin inhibitory activity. The most promising extracts were selected in terms of specific inhibitory activity, dose-response relationships, IC50 values and bioavailability of the species On the other hand, Intensity Fading MALDI-TOF MS, a proteomic method used in this work to complete the strategy of identification of inhibitors in marine extracts, was very useful to detect molecules, able to selectively interact with immobilized target enzymes, such as in N. versicolor against CPA and CPB, H. carunculata with pepsin, S. helianthus with papain, N. peloronta and S. helianthus with trypsin and L. isodyctialis with subtilisin. This work also describes the application of MALDI-TOF MS fragmentation in a characterization approach using the resolved molecular species obtained in the elution fraction of IF MALDI-TOF MS. Two examples are described: The first one is the major peak resulting of the interaction between H. carunculata and pepsin-NHS Sepharose™, which was fragmented by CID MALDI-TOF/TOF and analyzed by de novo sequencing. Another example uses the ISD MALDI-TOF MS fragmentation with the elution fraction of S. helianthus and trypsin-glyoxal Sepharose®. Another goal of this work was the purification and structural – functional characterization of NvCI, a proteinaceous carboxypeptidase inhibitor isolated from the marine snail N. versicolor. The combination of techniques such as automated Edman degradation and de novo sequencing by MALDI-TOF MS allowed the establishment of its primary structure. The synthesis and cloning of cDNA encoding NVCI allowed to confirm its amino acid sequence. NvCI is a protein with 53 amino acid residues, a molecular mass of 5944 Da and three intrachain disulfide bridges (UniProt code: P86912). Recombinant NvCI was produced in Pichia pastoris system with a high yield in terms of protein and activity. The kinetic characterization of natural and recombinant NvCI was performed according to the strategy described for tight-binding inhibitors. Natural and recombinant NvCI displayed Ki values in the picomolar range against carboxypeptidases such as bCPA1, hCPA1 and hCPA4. Other Ki values are in the order of 1x10-10 M (hCPB1, pCPB1, hTAFI and bTAFI), except for hCPA2 (1x10-9 M). NvCI is a competitive reversible tight binding inhibitor which represents the most potent carboxypeptidase inhibitor from proteinaceous nature so far described. The X-ray structure of NvCI-hCPA4 complex (PDB code: 4A94) showed that the inhibitor is basically formed by a central anti-parallel β-two-stranded sheet connected by three major loops. The β-strands are stabilized by three disulfide bridges, a small hydrophobic core located next to the C-terminus of NvCI and a few bulky exposed hydrophobic residues to the solvent. NvCI displays a total contact area of 1875.1 Å2 with hCPA4. The inhibition mechanism of NvCI is due to a competitive interaction with the active site of the carboxypeptidase, by occlusion of the subsites S1’, S1, S2 and S3, as it has been observed for most of the reported proteinaceous carboxypeptidase inhibitors. These sites are occupied by the C-terminal tail of NvCI and constitute the primary contact region of the inhibitor. The secondary contact region is more extended and covers almost one face of the inhibitor. The lower Ki values observed for NvCI in comparison to the other inhibitors can be attributed to both, the “primary” and “secondary” interaction regions, which create an extended interface with the carboxypeptidase that minimizes the product release from the catalytic reaction.

Keywords

NVCI; MCP inhibitor; IF Madi-tof MS

Subjects

577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics

Knowledge Area

Ciències Experimentals

Documents

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