Estudi de la rellevància dels membres anti-apoptòtics de la família de Bcl-2 en la resistència a la mort induïda per la via extrínseca a través dels lligands de mort

Abstract

L’activació de la via extrínseca de l’apoptosi és promoguda per l’activació dels anomenats “receptors de mort”. En aquest treball demostrem que l’expressió d’un súper-repressor d’NF-κB (SR-IκBα) sensibilitza a les cèl·lules HeLa a l’apoptosi, però no a la necroptosi, induïda per TNFα. Aquest procés involucra l’activació de les caspasses i l’alliberament del citocrom c de la mitocòndria. El silenciament específic de cada un dels membres anti-apoptòtics de la família de Bcl-2 indica que Bcl-xL te un rol específic i no redundant en la regulació de l’activació de la via de supervivència o de mort induïda per TNFα, sense alterar l’activació d’NF-κB. En aquest context, es mostra que el silenciament de Bcl-xL no impedeix la regulació a l’alça, induïda per TNFα, de cIAP2, un gen diana d’NF-κB. A més a més, el silenciament de Bcl-xL no incrementa el percentatge de nuclis apoptòtics en front a l’estímul de TNFα en cèl·lules que sobre-expressen el SR-IκBα. A més, aquest resultats han estat corroborats en altres línies tumorals, com les cèl·lules RD i DU-145, demostrant que esdevenen sensibles a l’apoptosi induïda per TNFα quan Bcl-xL està silenciat, sense afectar a l’activació d’NF-κB. En conjunt, aquests resultats suggereixen quan Bcl-xL no és funcional, NF-κB no pot exercir el seu rol protector encara que la seva activitat transcripcional no es vegi alterada. D’altra banda, estimulant un panell més estens de línies cel·lulars amb TNFα, també s’ha pogut establir que algunes d’elles són resistents a l’acció de la citoquina malgrat el silenciament de l’expressió de Bcl-xL com, per exemple, la majoria de les línies cel·lulars derivades de glioblastoma multiforme humà (GBM). En canvi, utilitzant com a model cel·lular de GBM les cèl·lules U87MG, s’ha demostrat que aquestes esdevenen sensibles a l’acció de TRAIL quan l’expressió de Bcl-xL, però no de Bcl-2, Bcl-w o Mcl-1, es troben silenciada. Aquesta mort cel·lular és de tipus apoptòtic i involucra, tant l’activació de caspasses com l’alliberament de citocrom c i Smac / DIABLO de la motocòndria. El silenciament d’Smac / DIABLO és capaç de revertir la sensibilització provocada per la disminució en els nivells de Bcl-xL en front a l’estímul citotòxic de TRAIL, malgrat les caspasses esdevenent processades en els seus fragments d’activació. En conjunt, els resultats presentats en aquesta tesi demostren que la proteïna anti-apoptòtica Bcl-xL juga un paper clau no redundant en l’apoptosi induïda per via extrínseca i que la funció de protecció exercida per Bcl-xL recau en la inhibició de l’alliberament d’Smac / DIABLO cap al citosol.

The activation of the extrinsic pathway is promoted when the death receptors are triggered. In the present study we demonstrate that the expression of a super-repressor of NF-κB (SR-IκBα) sensitizes HeLa cells towards apoptosis, but not necroptosis, induced by TNFα. This process involves both the activation of caspases and the release of cytocrome c from the mitochondria. The specific knockdown of each anti-apoptotic member of the Bcl-2 family unravels a specific and non-redundant role of Bcl-xL, which regulates the TNFα-mediated switch between cell survival and cell death without affecting NF-κB activation. In this context, we show that the silencing of Bcl-xL does not impair TNFα-mediated cIAP2 upregulation, a well-known NF-κB gene target. Furthermore, Bcl-xL knockdown does not raise the number of apoptotic nuclei in SR-IκBα-transformed cells after TNFα challenge. Finally, we corroborate these results to other kinds of tumoral cells such as RD and DU-145, showing that both become sensitive to TNFα when Bcl-xL is downregulated without affecting NF-κB activation. Altogether, these results suggest that when Bcl-xL function is impaired, NF-κB cannot exert its protective role, even though its transcriptional function remains unaltered. Otherwise, the use of a more extensive panel of cell lines cultured in the presence of TNFα, allowed us to stablish that some of them are resistant to the citotoxic effect of the citoquine, even when Bcl-xL is downregulated. However, we wanted to ascertain whether these Bcl-xL-silenced TNFα-resistant cells were also insensitive to other death ligands, such as TRAIL. Among those cells, we were interested in human glioblastoma multiforme (GBM)-derived cell lines. By using U87MG cells as a cellular model of GBM-derived cells, we show that the specific knockdown of Bcl-xL, but not that of Bcl-2, Bcl-w or Mcl-1, renders cells sensitive to TRAIL-induced apoptosis. This cell death is apoptotic and involves the activation of caspases and the cytosolic release of both cytocrome c and Smac / DIABLO from the mitochondria. The downregulation of Smac / DIABLO is able to prevent the sensibilization afforded by Bcl-xL knockdown towards TRAIL-mediated cytotoxicity, even though the caspases become processed into their active fragments. Overall, the results presented in this dissertation demonstrate that, first, the anti-apoptotic protein Bcl-xL plays a key and non-redundant role in the execution of the apoptotic program induced by the activation of the death receptors and, second, that the protective function exerted by Bcl-xL relies on the prevention of Smac / DIABLO release to the cytosol.