Research on cardiac differentiation from human pluripotent stem cells: how to get beating cells in a dish

Autor/a

Oñate Monje, Lorena de

Director/a

Montserrat Pulido, Núria

Fecha de defensa

2015-11-23

Páginas

333 p.



Departamento/Instituto

Universitat Pompeu Fabra. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut

Programa de doctorado

Programa de doctorat en Biomedicina

Resumen

Probably, the gain in organ complexity and cell function has led to a decrease in healing capacities in the adult mammalian heart. In an effort to generate new venues for the generation of functional cardiac cells, in the present work we have explored the possibility to manipulate cell fate and plasticity making use of different technologies. First, and taking advantage of somatic cell reprogramming we have generated induced pluripotent stem cells (iPSCs) from umbilical cord derived mesenchymal stem cells (ucMSCs), an amenable source of stem cells in the clinical setting. In a very simple manner we have converted ucMSCs into iPSCs with either four transcription factors (OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC) or two transcription factors (OCT4 and SOX2). Second, by a cell conversion approach, we have been able to produce cells expressing cardiac-related markers at the protein level from human post-natal dermal fibroblasts. Our protocol induces cell de-differentiation by the overexpression of OCT4 and SOX2 pluripotent-related transcription factors first, and the specific meso-cardiac transcriptional factor GATA4 afterwards. Finally, in order to define new conditions for the generation of cardiac-like cells from either pluripotent stem cells or somatic cells, we have developed a reporter cell line for the cardiac gene alpha Myosin Heavy Chain (MYH6) by means of TALEN and CRISPR/CAS9 genome editing technologies. In this manner we have been able to explore culture conditions promoting cardiac differentiation from human embryonic stem cells. The work presented here shows different approaches aiming to generate cardiac-like cells with an impact in Regenerative Medicine.


És probable que l’adquisició de complexitat tant en els òrgans, com en les funcions cel•lulars al llarg de l’evolució hagi portat a la disminució de les capacitats d’autocuració del cor de mamífers adults. Per tal de generar noves plataformes per la generació de cèl•lules cardíaques funcionals, en el treball exposat a continuació, hem explorat la possibilitat de manipular tant el destí com la plasticitat cel•lular fent servir diferents tecnologies. En primer lloc, aprofitant la reprogramació somàtica, hem generat cèl•lules mare pluripotents induïdes (iPSCs) a partir de cèl•lules mare mesenquimals derivades de sang de cordó umbilical (ucMSCs), una font fàcilment accessible de cèl•lules mare en l’entorn clínic. De manera senzilla, hem aconseguit convertir ucMSCs en iPSCs amb quatre (OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC) o amb tan sols dos factors de transcripció (OCT4 i SOX2). En segon lloc, mitjançant una estratègia de conversió cel•lular, hem aconseguit produir cèl•lules que expressen marcadors relacionats amb teixit cardíac a nivell proteic a partir de fibroblasts dèrmics post-natals d’origen humà. El nostre protocol indueix en una primera fase la de-diferenciació dels fibroblasts mitjançant la sobre expressió primer dels factors de pluripotència OCT4 i SOX2, i després del factor de transcripció específic per mesoderm cardíac GATA4. Finalment, amb l’objectiu de definir noves condicions per la generació de cèl•lules cardíaques a partir de cèl•lules mare pluripotents o cèl•lules somàtiques hem enginyat una línia cel•lular reportera pel gen cardíac que codifica per la cadena pesant de la miosina (alpha myosin heavy chain o MYH6) mitjançant les tècniques d’edició gènica TALEN i CRISPR/CAS9. D’aquesta manera hem estat capaços d’explorar diferents condicions de cultiu per promoure la diferenciació cardíaca a partir de cèl•lules mare pluripotents d’origen embrionari. El treball aquí exposat, mostra diferents estratègies dissenyades amb la intenció de generar cèl•lules cardíaques amb un cert impacte en la futura Medicina Regenerativa.

Palabras clave

Cardiac differentiation; Cell conversion; Genome editing; Reprogramming; Diferenciació cardíaca; Conversió cel·lular; Edició gènica; Cèl·lules mare pluripotents; Pluripotent stem cells

Materias

576 - Biología celular y subcelular. Citología

Documentos

tlom.pdf

6.362Mb

CHAPTER 2 VIDEO 1. ES4 CARDIAC differentiation from EBs at day 20.mov

2.778Mb

CHAPTER 3 ES4 CARDIAC differentiation in monolayer day 20 (10X).mov

43.09Mb

CHAPTER 3 ES4 CARDIAC differentiation in monolayer day 20 (20X).mov

2.602Mb

CHAPTER 3 VIDEO 1 TALEN MYH6_mCherry beating at day 9.mov

150.3Kb

CHAPTER 3 VIDEO 2 TALEN MYH6_mCherry beating at day 20.mov

234.6Kb

 

Derechos

ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.

Este ítem aparece en la(s) siguiente(s) colección(ones)