Universitat Pompeu Fabra
Gebauer, Fátima
2017-12-11
154 p.
Universitat Pompeu Fabra. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut
Cytoplasmic polyadenylation is a widespread mechanism to control mRNA translation. In vertebrates, this mechanism requires two sequence elements in the 3’ UTR of substrate mRNAs, the U-rich Cytoplasmic Polyadenylation Element (CPE) and the AAUAAA polyadenylation hexanucleotide (HN). In Drosophila early embryos, the cytoplasmic polyadenylation of Toll mRNA occurs independently of these elements, and requires Dicer-2, a factor previously known for its functions in RNA interference (RNAi), in addition to the poly(A) polymerase Wispy. To understand this novel function of Dicer-2 in cytoplasmic polyadenylation and translation, we aimed to dissect the required cisacting requirements in Toll mRNA, and to identify Dicer-2 protein partners and mRNA targets. We found that multiple signals in the 3’ UTR of Toll cooperate for polyadenylation, and that in early embryos the non-canonical signals dominate, probably due to the presence of inhibitory elements for canonical polyadenylation. Interactome analysis using affinity purification of Dicer-2 and mass spectrometry revealed that Dicer-2 interacts with multiple proteins outside the RNAi pathway. Importantly, proteins involved in poly(A) tailmediated translational regulation and PABP binding were identified, suggesting potential co-factors of Dicer-2 in polyadenylation. Furthermore, RIP-Seq analysis of Dicer-2 revealed enrichment of mRNAs which were previously found downregulated in wispy mutants. These results suggest that the role of Dicer-2 in cytoplasmic viii polyadenylation might be widespread, and provide the basis for future investigation.
La poliadenilación citoplasmática es un mecanismo de control de la traducción extendido a lo largo de la escala animal. En vertebrados, este mecanismo requiere dos secuencias en el extremo 3’ no traducido (UTR) del mRNA, el elemento de poliadenilación citoplasmática rico en uridinas (CPE) y el hexanucleótido de poliadenilación AAUAAA (HN). En embriones tempranos de Drosophila, la poliadenilación de Toll, sin embargo, ocurre independientemente de estas secuencias, y requiere al menos dos factores: Dicer-2, una proteína previamente implicada en interferencia de RNA (RNAi), y la poly(A) polimerasa Wispy. Para entender esta nueva función de Dicer-2 en poliadenilación citoplasmática y traducción, nos propusimos diseccionar los elementos en el extremo 3’ UTR de Toll relevantes para este mecanismo de poliadenilación no canónica, así como identificar proteínas y mRNAs que interaccionan con Dicer-2 a gran escala. Nuestros resultados indican que el extremo 3’ UTR de Toll contiene varias secuencias implicadas en poliadenilación, y que el mecanismo no canónico es dominante en embriones tempranos, probablemente porque los elementos canónicos (CPE y HN) se encuentran activamente reprimidos. El estudio del interactoma de Dicer-2, realizado por purificación por afinidad e identificación por espectrometría de masas, reveló numerosas proteínas que no están implicadas en RNAi. Entre ellas, encontramos factores previamente relacionados con control de la longitud del poly(A) o con interacción con PABP y traducción, sugiriendo que estos factores podrían actuar x como co-factores de Dicer-2 en poliadenilación citoplasmática. Análisis de mRNA targets mediante RIP-Seq reveló multiples tránscritos que previamente fueron identificados como targets de Wispy. Estos resultados sugieren una función extendida de Dicer-2 en poliadenilación citoplasmática, y establecen una base sólida para investigaciones futuras.
Cytoplasmic polyadenylation; Drosophila Dicer-2; RNA binding proteins; 3'UTR; Translation; Poliadenilación citoplasmática; Proteínas de unión a ARN; Traducción
576 - Cellular and subcellular biology. Cytology
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