Implicación de nucleoporinas y su relación con alteraciones de proteóstasis de TDP-43 secundarias a estrés celular en la fisiopatología de la ELA

Abstract

L’esclerosis lateral amiotròfica (ELA) és una malaltia neurodegenerativa caracteritzada per canvis citopatològics en les motoneurones inferiors dels tronc cerebral i de la medul•la espinal, així com en les motoneurones superiors de l’escorça motora. Els pacients que pateixen aquesta patologia experimenten signes i símptomes d’atròfia muscular progressiva secundaria amb debilitat, augment de la fatiga, disfàgia que s’acompanya d’insuficiència respiratòria i la mort. L’ELA es classifica en dos amplies categories cínicament molt similars, l’ELA familiar (ELAf) que s’associa a mutacions en un conjunt de gens i que compren al voltant del 10 % de tots els casos d’ELA, i l’ELA esporàdica (ELAe). Una de les característiques patognomòniques de l’ELA és la formació d’agregats de naturalesa proteica, generalment citoplasmàtics, que es localitzen en les motoneurones. Un dels components majoritaris en aquestes estructures proteiques és la ribonucleoproteïna TDP-43, la qual es troba deslocalitzada en el citoplasma cel•lular, fragmentada i anormalment fosforilada. L’etiopatogènia de la malaltia i els processos pels quals passa la desregulació de TDP-43, son desconeguts a l’actualitat. No obstant, diversos mecanismes moleculars s’han associat amb l’agregació de TDP-43 entre els quals destaquen l’estrès oxidatiu, l’estrès de reticle, la disfunció del flux autofàgic i de l’activitat proteosomal, així com el deteriorament del transport nucleocitosòlic, entre altres. Aquest, al seu torn, pot dependre de la integritat estructural i funcional de l’embolcall nuclear, amb els seus components de membrana i els porus nuclears. En aquesta tesis s’aborda l’estudi de les subunitats proteiques que conformen el porus nuclear, les nucleoporines (NUPs) i la seva alteració com un mecanisme subjacent en l’etiopatogènia de la ELA, contribuint a la deslocalització de proteïnes i la seva potencial agregació, utilitzant TDP-43 com a paradigma. Per això van analitzar els nivells de varis NUPs mitjançant tècniques de immunodetecció en teixits i nuclis aïllats extrets post mortem de pacients d’ELA, així com en un model murí transgènic d’ELAf en varis estadis de la malaltia y en ambdós sexes. A més, es van realitzar estudis de cultiu cel•lular per elucidar els possibles mecanismes que influeixen en la desregulació de TDP-43 mediat per NUPs. En aquest context es va abordar la relació entre estrès cel•lular, TDP-43 i NUPs, per establir la possible influència dels mecanismes d’estrès sobre la distribució de NUPs específiques i la seva relació amb les característiques patològiques de TDP-43. Els resultats demostren canvis en els nivells de NUPs que participen en el reconeixement de proteïnes transportadores, tant en teixits extrets post mortem de pacients d’ELA com en ratolins models de la malaltia. Per altra banda, el silenciament d’una de les NUPs, la NUP107, va provocar un augment dels nivells de TDP-43 i de la seva fosforilació, així com un augment de la formació dels seus agregats citoplasmàtics. A més, això s’associa a una alteració de la resposta autofàgica, evidenciat pel increment de LC3II, p62 i els nivells de ubiquitinització proteica general. De la mateixa manera, l’estrès oxidatiu i l’estrès osmòtic in vitro van provocar un increment de les característiques patològiques de TDP-43 citades anteriorment, augment associat a canvis en l’expressió de NUPs. Aquestes troballes demostren que el deteriorament de les NUPs en el marc de la ELA pot ser un mecanisme contribuent a l’alteració del tràfic intracel•lular, resultant en l’agregació de proteïnes implicades en la neurodegeneració motoneuronal, com TDP-43.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por cambios citopatológicos en las motoneuronas inferiores del tronco cerebral y de la médula espinal, así como en las motoneuronas superiores de la corteza motora. Los pacientes que sufren esta patología experimentan signos y síntomas de atrofia muscular progresiva secundaria con debilidad, aumento de la fatiga, disfagia que se acompañan de insuficiencia respiratoria y la muerte. La ELA se clasifica en dos amplias categorías clínicamente muy similares; la ELA familiar (ELAf) que se asocia a mutaciones en un conjunto de genes, la cual comprende alrededor del 10 % de todos los casos de ELA, y la ELA esporádica (ELAe). Una de las características patognomónicas de la ELA es la formación de agregados de naturaleza proteica, generalmente citoplasmáticos, que se localizan en las motoneuronas. Uno de los componentes mayoritarios en estas estructuras proteicas es la ribonucleoproteína TDP-43, la cual se encuentra deslocalizada en el citoplasma celular, fragmentada y anormalmente fosforilada. La etiopatogenia de la enfermedad y los procesos por los cuales ocurre la desregulación de TDP-43, son desconocidos en la actualidad. No obstante, diversos mecanismos moleculares han sido asociados con la agregación de TDP-43 entre los cuales destacan el estrés oxidativo, el estrés de retículo, la disfunción del flujo autofágico y de la actividad proteosomal, así como el deterioro del transporte nucleocitosólico, entre otros. Éste, a su vez, puede depender de la integridad estructural y funcional de la envoltura nuclear, con sus componentes membranales y los poros nucleares. En esta tesis se aborda el estudio de las subunidades proteicas que conforman el poro nuclear, las nucleoporinas (NUPs) y su alteración como un mecanismo subyacente en la etiopatogenia de la ELA, contribuyendo a la deslocalización de proteínas y su potencial agregación, utilizando TDP-43 como paradigma. Para ello analizamos los niveles de varias NUPs mediante técnicas de inmunodetección en tejidos y núcleos aislados extraído post mortem de pacientes de ELA, así como en un modelo murino transgénico de ELAf en varios estadios de la enfermedad y en ambos sexos. Además, realizamos estudios en cultivo celular para elucidar los posibles mecanismos que influyen en la desregulación de TDP-43 mediado por NUPs. En este contexto se abordó la relación entre estrés celular, TDP-43 y NUPs, para establecer la posible influencia de los mecanismos de estrés sobre la distribución de NUPs específicas y su relación con las características patológicas de TDP-43. Los resultados demuestran cambios en los niveles de NUPs que participan en el reconocimiento de proteínas transportadoras, tanto en tejidos extraídos post mortem de pacientes de ELA como en ratones modelos de la enfermedad. Por otro lado, el silenciamiento de una de las NUPs, la NUP107, provocó aumento de los niveles de TDP-43 y de su fosforilación, así como un aumento de la formación de sus agregados citoplasmáticos. Además, ello se asocia a una alteración de la respuesta autofágica, evidenciado por el incremento de LC3II, p62 y los niveles de ubiquitinización proteica general. De igual manera, el estrés oxidativo y el estrés osmótico in vitro provocaron un incremento de las características patológicas de TDP-43 citadas anteriormente, aumento asociado a cambios en la expresión de NUPs. Estos hallazgos demuestran que el deterioro de las NUPs en el marco de la ELA, puede ser un mecanismo contribuyente a la alteración del tráfico intracelular, resultante en la agregación de proteínas implicadas en la neurodegeneración motoneuronal, como TDP-43.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease, characterized by cytopathologic changes in the lower motor neurons of the brainstem and spinal cord, as well as in the upper motor neurons of the motor cortex. Patients suffering this pathology, experience signs and symptoms of secondary progressive muscular atrophy with weakness, increased fatigue, dysphagia accompanied by respiratory failure and death. ALS is classified into two broad categories that are clinically very similar; the familial ALS (fALS) that is associated with mutations in a set of genes, which comprises about 10% of all cases of ALS, and sporadic ALS (sALS). One of the pathognomonic characteristics of ALS is the usually cytoplasmic protein nature aggregates formation that is located in motor neurons. One of the major components in these protein structures is the TDP-43 ribonucleoprotein, which is delocalized, fragmented and abnormally phosphorylated in the cellular cytoplasm. The etiopathogenesis of the disease and the processes by which TDP-43 deregulation occurs are currently unknown. However, several molecular mechanisms have been associated with the TDP-43 aggregation, among which oxidative stress, reticular stress, autophagic flow dysfunction and proteasomal activity, as well as nucleocytosolic transport deterioration, among others . This, in turn, may depend on the structural and functional integrity of the nuclear envelope, with its membrane components and nuclear pores. This thesis addresses the study of the protein subunits that build the nuclear pore, nucleoporins (NUPs) and their alteration as an underlying mechanism in the etiopathogenesis of ALS, contributing to protein offshoring and its potential aggregation using TDP- 43 as a paradigm. To do this, we analysed the levels of several NUPs by immunodetection techniques in isolated tissues and nuclei extracted post mortem from ALS patients, as well as in a transgenic murine model of ALS in several stages of the disease and in both sexes. In addition, we performed cell culture studies to elucidate the possible mechanisms that influence NUPs-mediated TDP-43 dysregulation. In this context, the relationship between cell stress, TDP-43 and NUPs was discussed to establish the possible influence of stress mechanisms on the distribution of specific NUPs and their relation to the TDP-43 pathological characteristics. The results demonstrate changes in the levels of NUPs involved in the recognition of transporter proteins in both post-mortem tissues from ALS patients and in model mice from the disease. On the other hand, the silencing of one of the NUPs, NUP107, caused an increase in the levels of TDP-43 and its phosphorylation, as well as an increase in the formation of its cytoplasmic aggregates. In addition, this is associated with autophagic response alterations, evidenced by the increase of LC3II, p62 and the levels of general protein ubiquitination. Similarly, oxidative stress and osmotic stress in vitro, caused an increase in the pathological characteristics of TDP-43 mentioned above, an increase associated with changes in the expression of NUPs. These findings demonstrate that the deterioration of NUPs in the ALS framework may be a contributing mechanism to the alteration of intracellular traffic resulting in the proteins aggregation involved in motoneuronal neurodegeneration, such as TDP-43.