Bacteriophage detection and quantification in transparent and turbid samples

Abstract

La majoria de les tècniques de detecció i quantificació de bacteriòfags s’han desenvolupat per a aplicacions en entorns industrials i de salut pública, i durant molts anys els mètodes convencionals com la doble capa d’agar i la microscòpia electrònica han estat l’única opció disponible per a la seva detecció i quantificació. Aquests mètodes són costosos en temps i en mà d’obra o requereixen equips cars, respectivament. La situació ha canviat amb la introducció de tecnologies que aporten noves solucions i alternatives als mètodes convencionals. Per construir una eina eficaç, els mètodes de detecció de fags han de tenir en consideració diversos factors: 1) tipus de bacteriòfag; 2) nivell de sensibilitat requerit; 3) disponibilitat d’hostes cultivables; 4) possible interferència de la matriu de la mostra; 5) disponibilitat d’equips sofisticats i/o personal altament qualificat i, condicionant la major part dels anteriors, 6) tipus d’aplicació (teràpia fàgica, estudis de biocontrol, indústria de fermentació d’aliments o control ambiental). El treball desenvolupat en aquesta tesi explora la possibilitat de detectar i quantificar bacteriòfags específics mitjançant l’anàlisi del comportament dinàmic del sistema hoste-bacteriòfag. El conjunt de dades obtingut s’ha publicat i posat a disposició de la comunitat, ja que constitueix probablement el primer estudi detallat sobre la dependència de la concentració de hoste-bacteriòfag que s’ha publicat des de que els bacteriòfags es van descobrir a la dècada de 1920. Tots aquests elements es poden utilitzar com a base per al desenvolupament de mètodes específics adaptats a qualsevol de les àrees esmentades anteriorment. En la primera fase, hem seguit els canvis de densitat òptica (DO) durant la lisi de cultius induïda per fags en mitjans transparents per avaluar la cinètica de hoste-bacteriòfag en 90 combinacions diferents de concentracions de bacteris/fags. En una segona fase s’han emprat les propietats fluorescents de l’indicador redox resazurina per superar els problemes observats quan s’intenten realitzar mesuraments cinètiques de densitat òptica en medis de terbolesa elevada. Gràcies a les propietats fluorescents de la resazurina, s’ha pogut avaluar la cinètica hoste-bacteriòfag de 186 combinacions diferents de concentracions de bacteris/fags en medis tèrbols sintètics així com en una matriu d’alta complexitat com la llet. Tant l’enfoc basat en DO com el basat en fluorescència són complementaris i tenen un límit de detecció i un temps de detecció similars (50 ufp/ml en 3,5 h). L’assaig basat en DO és quantitatiu. L’assaig fluorescent basat en resazurina és semiquantitatiu però més ràpid, detectant números alts de fags en menys de 60 min. El principi de funcionament d’ambdós assajos és molt flexible i es pot adaptar fàcilment a qualsevol aplicació específica triant la combinació correcta d’hoste-bacteriòfag, ja sigui en mostres netes o tèrboles. Finalment, la tecnologia utilitzada és relativament simple i molt adequada per a la seva posterior miniaturització, automatització i aplicació a anàlisi d’alt rendiment.

La mayoría de las técnicas de detección y cuantificación de bacteriófagos se han desarrollado para aplicaciones en entornos industriales y de salud pública, y durante muchos años los métodos convencionales como la doble capa de agar y la microscopía electrónica han sido la única opción disponible para su detección y cuantificación. Estos métodos son costosos en tiempo y en mano de obra o requieren equipos caros, respectivamente. La situación ha cambiado con la introducción de tecnologías que aportan nuevas soluciones y alternativas a los métodos convencionales. Para construir una herramienta eficaz, los métodos de detección de fagos deben tener en consideración varios factores: 1) tipo de fago; 2) nivel de sensibilidad requerido; 3) disponibilidad de huéspedes cultivables; 4) posible interferencia de la matriz de la muestra; 5) disponibilidad de equipos sofisticados y/o personal altamente calificado y, condicionando la mayor parte de los anteriores, 6) tipo de aplicación (terapia fágica, estudios de biocontrol, industria de fermentación de alimentos o control ambiental). El trabajo desarrollado en esta tesis explora la posibilidad de detectar y cuantificar bacteriófagos específicos mediante el análisis del comportamiento dinámico del sistema fago-huésped. El conjunto de datos obtenido se ha publicado y puesto a disposición de la comunidad, ya que constituye probablemente el primer estudio detallado sobre la dependencia de la concentración de fago-huésped que se ha publicado a partir del descubrimiento de bacteriófagos en la década de 1920. Todos estos elementos se pueden utilizar como base para el desarrollo de métodos específicos adaptados a cualquiera de las áreas mencionadas anteriormente. En la primera fase, hemos seguido los cambios de densidad óptica (DO) durante la lisis de cultivo inducida por fagos en medios transparentes para evaluar la cinética del huésped-fago en 90 combinaciones diferentes de concentraciones de bacterias/fagos. En una segunda fase se han empleado las propiedades fluorescentes del indicador redox resazurina para superar los problemas observados cuando se intentan realizar mediciones cinéticas de densidad óptica en medios de alta turbidez. Gracias a las propiedades fluorescentes de la resazurina, se ha evaluado la cinética fago-huésped de 186 combinaciones diferentes de concentraciones de bacterias/fagos en medios turbios sintéticos, así como en una matriz de alta complejidad como la leche. Tanto los enfoques basados en DO como en fluorescencia son complementarios y tienen un límite de detección y un tiempo de detección similares (50 ufp/ml en 3,5 h). El ensayo basado en DO es cuantitativo. El ensayo fluorescente basado en resazurina es semicuantitativo pero más rápido, detectando números altos de fagos en menos de 60 min. El principio de funcionamiento de ambos ensayos es muy flexible y se puede ajustar fácilmente a cualquier aplicación específica eligiendo la combinación correcta de fago-huésped, ya sea en muestras limpias o turbias. Finalmente, la tecnología utilizada es relativamente simple y muy adecuada para su posterior miniaturización, automatización y aplicación a análisis de alto rendimiento.

Most of the phage detection and quantification techniques are developed for applications in public health and industry environments, and for many years conventional methods like Double Agar Layer and Electron Microscopy were the only available option to detect and quantify phages. These methods are either labour intensive and time consuming or require expensive equipment, respectively. However, this has changed with the introduction of novel technologies that brings new solutions and alternatives to conventional methods. In order to build an effective tool, phage detection methods must take into account several factors: 1) type of phage; 2) level of sensitivity required; 3) availability of cultivable hosts; 4) possible interference by the sample matrix; 5) availability of sophisticated equipment and/or highly skilled personnel and, conditioning most of the above, 6) type of application (phage therapy, bio-control studies, food fermentation industry or environmental monitoring). The work developed in this thesis explores the possibility of carrying out sensitive detection and quantification of specific phages, by analyzing the dynamic behavior of the phage-host system. The dataset has been published and made available to the community as it constitutes probably the first detailed study on phage-host concentration dependence that has been published from the discovery of bacteriophages in the 1920’s. All of these elements can be used as the basis for the development of specific methods tailored to any of the areas mentioned above. In the first phase we have monitored optical density (OD) changes during phage-induced culture lysis in clear media in order to evaluate phage-host kinetics over 90 different combinations of bacteria/phage concentrations. In a second phase the fluorescent properties of the redox dye resazurin have been employed to overcome the problems observed when attempting to perform optical density kinetic measurements in media of high turbidity. Thanks to the fluorescent properties of resazurin, the phage-host kinetics of 186 different combinations of bacteria/phage concentrations have been evaluated in synthetic turbid media as well as in a high complexity matrix such as milk. Both OD and fluorescence-based approaches are complementary and have similar LOD and Time of Detection (5x101 pfu/mL in 3.5 h). OD-based assay is quantitative, and the resazurin assay is semi-quantitative but faster, detecting high phage numbers in less than 60 min. The working principle of both assays is highly flexible and can be easily adjusted to any specific application by choosing the right phage-host combination whether it be in clean or turbid samples. Finally, the technology used is relatively simple and well suited for further miniaturization, automatization and high-throughput analysis.