Baxalpha5 at lipid membranes: structure, assembly and pore formation

Author

Fuertes Vives, Gustavo

Director

Salgado Benito, Jesús

Date of defense

2011-04-29

ISBN

9788437082264

Pages

351 p.



Department/Institute

Universitat de València. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Abstract

Las proteínas de la familia Bcl-2 controlan la liberación de citocromo c, y otros factores apotogénicos, desde la mitocondria hacia el citosol. Los miembros proapoptóticos de la familia, como Bax, facilitan dicha liberación probablemente a través de la formación de poros proteolipídicos a nivel de la membrana mitocondrial externa. Por el contrario, los miembros antiapoptóticos, como Bcl-xL, bloquean la acción de Bax. Con el objetivo de mejorar nuestro conocimiento sobre la estructura y formación de poros por parte de Bax así como de la estructura y cinética de los poros inducidos por Bax, optamos por una aproximación reduccionista consistente en el estudio de un dominio activo derivado de la hélice quinta de Bax, Bax5. A través del trabajo desarrollado en este Tesis, hemos encontrado que dicho péptido se une espontáneamente a membranas lipídicas, plegándose en forma de hélice-. Bax5 es capaz de formar dímeros, tanto en micelas de SDS como en membranas de POPC, así como oligómeros mayores en presencia de lípidos mitocondriales. Dicha capacidad de autoensamblaje depende especialmente de la presencia de un residuo de tirosina. Asimismo, Bax5 forma heteroligómeros con polipéptidos derivados de Bcl-xL, si bien dicha interacción no conduce a una inhibición de su capacidad formadora de poros. Un análisis mediante modelado de cuerpo rígido sugieren que la mejor orientación de Bax5 con respecto a la normal de la membrana, compatible con los datos experimentales, corresponde a un dímero esencialmente paralelo a la superficie de la bicapa. La formación de poros en membranas se ha estudiado tanto en poblaciones de vesículas como en liposomas individuales. Hemos puesto a punto métodos para analizar la actividad de los poros a cualquier tiempo tras la mezcla de Bax5 con vesículas, bien mediante la adición de reactivos que extinguen la fluorescencia de los lípidos marcados, o bien a través de la observación de entradas sucesivas de sondas fluorescentes en vesículas individuales gigantes. Como resultado observamos que las vesículas mantienen el estado porado a través del tiempo. Además, el radio de los poros individuales a tiempos largos o en estado de equilibrio es más pequeño (2.3 nm) que el de los poros “cinéticos”, o de tiempo corto. Finalmente, hemos demostrado que la actividad formadora de poros de Bax5 depende de la presencia de lisinas en posiciones específicas de la secuencia peptídica.


Proteins of the Bcl-2 family control the release of cytochrome c, and other apoptogenic factors, from the mitochondria to the cytosol. Proapoptotic members of the family, like Bax, facilitate such release most likely through the formation of proteolipidic pores in the outer mitochondria membrane (MOM). On the other hand, antiapoptotic members, like Bcl-xL, inhibit the permeabilization of the MOM by blocking Bax activation. The structure of membrane-bound species of Bax responsible for the formation of pores as well as the structure and kinetics of Bax-induced pores remain largely unexplored. In order to gain insight into the pore-forming mechanism of Bax, we have characterized the structure, assembly and pore formation properties of a minimal active domain derived from the fifth helix of Bax, Baxα5. We have found that Bax5 binds readily to lipid interfaces where it folds mainly as an α-helix. Both FRET and SDS-PAGE data suggest that Baxα5 is able to self-associate in lipid membranes and lipid-mimetic media, respectively. A detailed analysis of the residues involved in Bax5-Bax5 interactions suggests the presence of a glycophorin-like dimerization motif supplemented with a tyrosine residue. Interestingly, the number of Baxα5 molecules in the oligomers is dependent on the lipid composition, with mitochondrial lipids inducing higher-order oligomeric assemblies. Baxα5 is also able to interact with Bcl-xL-derived polypeptides. However, such heterotypic associations do not inhibit but rather enhance Baxα5-induced leakage from lipid vesicles. The structure of complexes of Baxα5 with membranes has been extensively studied by infrared spectroscopy and X-ray scattering. Two strategies have been used to best interpret the experimental data in terms of the orientation of Bax5 with respect to the membrane normal: an implicit orientational landscape model including distributions of the orientation angles and a rigid body modeling approach. Best fits are achieved using a dimeric starting structure which shows an almost flat alignment of Bax5 in POPC membranes and a more tilted state in DMPC bilayers. Importantly, the orientation displayed by Bax5 depends on lipid properties, such as fluidity and hydrophobic thickness. In turn, Bax5 seems to affect the properties of the surrounding lipid matrix. The pore-forming activity of Bax5 has been addressed both at the ensemble and single-vesicle level. Experiments with suspensions of liposomes allow recording the kinetics of dye release. However, these experiments are restricted to short times. In order to capture the activity of pores at any desired time after peptide/vesicle mixing we have developed two approaches. As a first approach, the quenching of fluorescent lipids by externally added reagents in ensembles of liposomes suggests the presence of pores or membrane defects at long times. Direct visualization of leakage events can be done observing single giant unilamellar vesicles (GUVs) under the fluorescence microscope. Successive leakage events in single GUVs indicate that the vesicle pore-state is maintained over time. Interestingly, individual long-term equilibrium pores have a smaller radius (2.3 nm) than short-term/kinetic pores suggesting that pores shrink with equilibration. Finally we have shown that the leakage activity of Bax5 depends on the presence and location of lysine residues within the primary structure.

Subjects

577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics

Knowledge Area

Facultat de Químiques

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