Ochratoxin A and ochratoxigenic modulds in grapes, must and wine. Ecophysiological studies

Author

Bellí Martí, Neus

Director

Sanchís Almenar, Vicente

Ramos Girona, Antonio J.

Date of defense

2006-01-20

ISBN

9788469063941

Legal Deposit

L-684-2007



Department/Institute

Universitat de Lleida. Departament de Tecnologia d'Aliments

Abstract

L'ocratoxina A (OTA) és un metabolit secundari tòxic produït essencialment per fongs<br/>dels gèneres Aspergillus i Penicillium, sota diverses condicions. La seva presència en el<br/>cos humà es deguda a la ingestió de petites quantitats provingudes d'un ampli ventall<br/>d'aliments, tant d'origen vegetal com animal. Després dels cereals, el vi és l'element en la<br/>dieta europea que més contribueix a l'ingesta d'OTA.<br/>L'OTA és una potent toxina que afecta principalment els ronyons, on pot provocar tant<br/>lesions agudes com cròniques. A part de la nefrotoxicitat, estudis toxicològics amb<br/>animals han demostrat que també te propietats genotòxiques, carcinogèniques i<br/>immunosupressives. A més, es sospita que és la causa d'una malaltia mortal per als<br/>humans observada en l'Europa de l'Est i coneguda com la 'Nefropatia Endèmica dels<br/>Balcans', així com de la formació de tumors en el tracte urinari d'humans.<br/>Breument, els objectius del present treball són: (i) fer una valoració del nivell de<br/>contaminació per OTA en begudes espanyoles derivades del raïm i estudiar la possible<br/>influència de diverses variables en el contingut d'OTA de vins i productes derivats; (ii)<br/>estudiar la micoflora de diverses vinyes espanyoles durant quatre anys consecutius<br/>mitjançant mostrejos de camp, per tal d'aclarir on, quan i fins a quin punt existeix OTA<br/>en aquest país; (iii) identificar i estudiar l'efecte de diversos factors ecofisiològics i de les<br/>seves interaccions en fongs potencialment productors d'OTA aïllats de raïm de<br/>vinificació, per tal de trobar les condicions que puguin minimitzar o prevenir el seu<br/>creixement i la formació de la toxina. Es van dur a terme estudis addicionals per<br/>investigar, en primer lloc, els efectes in vitro de l'aplicació de fungicides en raïm, i tot<br/>seguit, l'efecte del diferents tractaments fungicides en raïm al camp. També s'ha<br/>aconseguit visualitzar la colonització i els primers estadis d'infecció d'Aspergillus<br/>carbonarius en raïm, amb l'ajut de la microscopia de fluorescència làser confocal, epi- i<br/>estereomicroscopia, desprès de transformar aquest fong amb el gen de la proteïna de<br/>fluorescència verda (gfp).<br/>S'ha vist que prop d'un 20 % dels vins espanyols analitzats contenien OTA, la majoria a<br/>concentracions per sota dels límits establerts per la UE, i que els Aspergillus negres són<br/>els responsables de la producció d'aquesta toxina en aquest país, sobretot Aspergillus<br/>carbonarius. Malgrat el domini de les espècies de l'agregat A. niger en el raïm, i degut a<br/>la seva modesta capacitat de produir la toxina i a les baixes quantitats produïdes, la seva<br/>contribució al problema de l'OTA és ínfima. Les espècies uniseriades foren descartades<br/>en aquest aspecte, doncs no es va detectar toxina en cap de les soques aïllades.<br/>Els Aspergillus negres foren presents en el raïm des del quallat fins a la collita, en la<br/>majoria de vinyes. Tanmateix, la seva incidència augmentà amb la maduració del raïm,<br/>doncs les altes temperatures i humitat afavoriren el desenvolupament i producció d'OTA<br/>d'aquests fongs. Es va demostrar l'habilitat d'A. carbonarius de créixer en l'interval 10-<br/>45 ºC i 0,88-0,995 d'activitat d'aigua (aw), amb l'òptim al voltant de 30 ºC i a les més<br/>altes aw. Les condicions de temperatura favorables per a la producció d'OTA foren més<br/>restringides, essent 20 ºC i les altes aw les condicions òptimes. També s'estudiaren altres<br/>factors ecofisiològics com el país d'origen de les soques, les condicions de fotoperiode, l'<br/>alternança de temperatures, etc., doncs el coneixement dels factors que donen lloc a la<br/>producció d'OTA pot ajudar a dissenyar estratègies per limitar la seva formació.<br/>En la part final d'aquesta tesi s'han suggerit diverses maneres de prevenir i controlar els<br/>Aspergillus negres i la seva micotoxina. Com que s'ha vist que la producció d'OTA per<br/>Aspergillus negres és òptima poc temps desprès de la seva inoculació, la reducció del<br/>temps de collita i transport al celler serà decisiva per reduir els nivells d'aquesta toxina.<br/>També s'ha de procurar minimitzar els danys en la pell del raïm, doncs s'ha vist que les<br/>obertures fomenten la entrada del fong que es troba colonitzant la superfície,<br/>probablement afavorint la màxima producció d'OTA. L'execució d'altres mesures<br/>preventives com el control de fongs patògens i d'insectes durant el creixement del raïm -<br/>es varen fer assaigs amb diversos fungicides in vitro i in vivo-, i d'altres bones pràctiques<br/>agronòmiques, poden ajudar a reduir la contaminació per OTA del raïm.<br/>Com a conclusió general, s'ha vist que diversos factors poden ajudar a prevenir el<br/>desenvolupament dels fongs ocratoxigènics, però és necessari aplicar un sistema de<br/>mètodes combinats per tal de controlar el creixement i subseqüent producció d'OTA per<br/>aquests microorganismes. Les mesures preventives són sempre preferibles a les accions<br/>correctores, i junt amb un degut control de l'OTA en els derivats del raïm, asseguraran<br/>una adequada protecció del consumidor.


La ocratoxina A (OTA) es un metabolito secundario tóxico producido esencialmente por<br/>hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium, bajo diversas condiciones. Su presencia<br/>en el cuerpo humano es debida a la ingestión de pequeñas cantidades provenidas de un<br/>amplio abanico de alimentos, tanto de origen vegetal como animal. Después de los<br/>cereales, el vino es el elemento en la dieta europea que más contribuye a la ingesta diaria<br/>de OTA.<br/>La OTA es una potente toxina que afecta principalmente los riñones, dónde puede<br/>provocar tanto lesiones agudas como crónicas. A parte de la nefrotoxicidad, estudios<br/>toxicológicos en animales han demostrado que también tiene propiedades genotóxicas,<br/>carcinogénicas e inmunosupresivas. Además, se sospecha que es la causa de una<br/>enfermedad mortal para los humanos observada en la Europa del Este y conocida como la<br/>'Nefropatía Endémica de los Balcanes', así como de la formación de tumores en el tracto<br/>urinario de humanos.<br/>Brevemente, los objetivos del presente trabajo son: (i) valorar el nivel de contaminación<br/>por OTA en bebidas españolas derivadas de la uva y estudiar la posible influencia de<br/>varias variables en el contenido de OTA de vinos y productos derivados; (ii) estudiar la<br/>micoflora de distintos viñedos españoles durante cuatro años consecutivos mediante<br/>muestreos de campo, para esclarecer dónde, cuándo y hasta que punto existe OTA en este<br/>país; (iii) identificar y estudiar el efecto de varios factores ecofisiológicos y de sus<br/>interacciones en hongos potencialmente productores de OTA aislados de uva de<br/>vinificación, para encontrar las condiciones que puedan minimizar o prevenir su<br/>crecimiento y la formación de OTA. Se llevaron a cabo estudios adicionales para<br/>investigar en primer lugar los efectos in vitro de la aplicación de fungicidas en uva,<br/>seguido del efecto de diferentes tratamientos fungicidas en uva en el campo. También se<br/>ha conseguido visualizar la colonización y los primeros estadios de infección de<br/>Aspergillus carbonarius en uva, gracias a la microscopia de fluorescencia láser confocal,<br/>epi- y estereomicroscopia, después de transformar este hongo con el gen de la proteína de<br/>fluorescencia verde (gfp).<br/>Se vio que aproximadamente un 20 % de los vinos españoles analizados contenían OTA,<br/>la mayoría a concentraciones por debajo de los límites establecidos por la UE, y que los<br/>Aspergillus negros son los responsables de la producción de esta toxina en este país,<br/>sobretodo Aspergillus carbonarius. Pese al dominio de las especies del agregado A. niger<br/>en la uva, y debido a su modesta capacidad de producir la toxina y a las bajas cantidades<br/>producidas, su contribución al problema de la OTA es ínfima. Las especies uniseriadas<br/>fueron descartadas en este aspecto, ya que no se detectó toxina en ninguna de les cepas<br/>aisladas.<br/>Se detectaron Aspergillus negros en la uva desde el cuajado hasta la cosecha, en la<br/>mayoría de viñedos. No obstante, su incidencia aumentó con la maduración de la uva,<br/>pues las altas temperaturas y humedad favorecieron el desarrollo y producción de OTA<br/>por estos hongos. Se demostró la capacidad de A. carbonarius de crecer en el intervalo<br/>10-45 ºC y 0,88-0,995 de actividad de agua (aw), con el óptimo alrededor de 30 ºC y a las<br/>más altas aw. Las condiciones de temperatura favorables para la producción de OTA<br/>fueron más restringidas, siendo 20 ºC y las altas aw las condiciones óptimas. También se<br/>estudiaron otros factores ecofisiológicos como el país de origen de las cepas, las<br/>condiciones de fotoperiodo, la alternancia de temperaturas, etc., pues el conocimiento de<br/>los factores que dan lugar a la producción de OTA pueden ayudar a diseñar estrategias<br/>para limitar su formación.<br/>En la parte final de esta tesis se han sugerido varias maneras de prevenir y controlar los<br/>Aspergillus negros y su micotoxina. Como que se ha visto que la producción de OTA por<br/>los Aspergillus negros es óptima poco tiempo después de su inoculación, la reducción del<br/>tiempo de cosecha y transporte a la bodega será decisivo para reducir los niveles de esta<br/>toxina. También se ha de procurar minimizar los daños en la piel de la uva, pues se ha<br/>visto que las aperturas fomentan la entrada del hongo que se encuentra colonizando la<br/>superficie, probablemente permitiendo la máxima producción de OTA. La<br/>implementación de otras medidas preventivas como el control de hongos patógenos y de<br/>insectos durante el crecimiento de la uva -se ensayaron varios fungicidas in vitro e in<br/>vivo-, y de otras buenas prácticas agronómicas, pueden ayudar a reducir la contaminación<br/>por OTA de la uva.<br/>Como conclusión general, se ha visto que varios factores poden ayudar a prevenir el<br/>desarrollo de los hongos ocratoxigénicos, pero es necesario aplicar un sistema de métodos<br/>combinados para controlar el crecimiento y subsiguiente producción de OTA por estos<br/>microorganismos. Las medidas preventivas son siempre preferibles a las acciones<br/>correctoras, y junto con un debido control de la OTA en los derivados de la uva,<br/>aseguraran una adecuada protección del consumidor.


Ochratoxin A (OTA) is a toxic secondary metabolite produced by moulds belonging<br/>essentially to the Aspergillus and Penicillium genera, under diverse conditions. Its<br/>presence in the human body is due to the ingestion of small quantities present in a wide<br/>range of food commodities, both of vegetable and animal origin. Next to cereals, wine in<br/>the European diet is the second major source of OTA.<br/>OTA is a potent toxin affecting mainly the kidneys, in which it can cause both acute and<br/>chronic lesions. Besides nephrotoxicity, toxicological studies on animals have<br/>demonstrated that it has mainly, genotoxicity, carcinogenicity and immunosuppressive<br/>properties. Furthermore, it is suspected to be a possible cause of the fatal human disease<br/>known as Balkan endemic nephropathy observed in South Eastern Europe, and of the<br/>urinary tract tumours in humans.<br/>Briefly, the objectives of the present project are: (i) to assess the level of OTA<br/>contamination in Spanish grape-based beverages and to study the possible influence of<br/>several variables in the OTA content of wines and derivatives; (ii) to survey the<br/>mycoflora of several Spanish vineyards during four-year consecutive field samplings, in<br/>order to clarify where, when and to what extent OTA occurs in this country; (iii) to<br/>identify and study the effect of various ecophysiological factors and their interactions on<br/>potential ochratoxigenic fungi isolated from wine grapes, in order to find out the<br/>conditions that might minimize or prevent their growth and OTA formation. Additional<br/>studies to investigate, first the impact of application of fungicides to grapes in vitro, and<br/>later the effect of different fungicide treatments on grapes in the field, were carried out.<br/>Visualization of Aspergillus carbonarius grape colonization and early infection was also<br/>achieved with epi-, stereo- and confocal fluorescence microscopy, after the<br/>transformation of this fungus with the reporter green fluorescent protein gene (gfp).<br/>It has been shown that nearly 20 % of the Spanish wines tested contained OTA, most of<br/>them at concentrations below the EU limits, and that black aspergilli are responsible for<br/>the production of this toxin in this country, mainly A. carbonarius. Despite A. niger<br/>aggregate species were dominant in grapes, because of their modest ability and low<br/>amounts produced, their contribution to the OTA problem is rather small. Uniseriate<br/>species were discarded as a source of OTA in the surveyed regions, as no toxin was<br/>detected in any of the isolates.<br/>Black aspergilli were present on grapes from setting to harvest in most of the vineyards.<br/>However, their occurrence increased with grape maturity in the field, related to the fact<br/>that high temperature and humidity favoured black aspergilli development and OTA<br/>production. It was shown the growing ability of A. carbonarius in the range 10-45 ºC and<br/>0.88-0.995 of water activity (aw), with an optimum around 30 ºC and at the highest aw.<br/>Temperature conditions for OTA production were more restrictive, with optimum<br/>detected at 20 ºC and at the highest water availability. Other ecophysiological factors<br/>such as the country of origin of the strains, photoperiod conditions, alternation of<br/>temperatures, etc. were also studied, as understanding the factors leading to OTA<br/>synthesis will enable strategies to limit its formation.<br/>Several effective ways for prevention and control of black aspergilli and their dangerous<br/>mycotoxin have been suggested in the final part of this thesis. As OTA production by<br/>black aspergilli has been shown to occur optimally very early after inoculation,<br/>minimizing the harvesting and transport time to wine cellars might be crucial to reduce<br/>the toxin levels. Attention should also be paid in minimizing damages on grape skin, as it<br/>was shown that openings trigger the entrance of the fungi colonizing the berry surface,<br/>probably enabling production of maximum amounts of OTA. The implementation of<br/>other preventive measures such as controlling pathogenic fungi and insects during grape<br/>growing -some fungicides have been tested in vitro and in vivo-, and other good<br/>agricultural practices, may help in the reduction of OTA contamination in grapes.<br/>As a general conclusion, several factors were found to help in the prevention of<br/>ochratoxigenic fungi development, but it may be necessary to apply a multiple barrier<br/>approach to control the growth and subsequent OTA production of these microorganisms.<br/>Prevention measures are always preferable to corrective actions, and together with a<br/>proper control of OTA in grape-derivatives, should ensure the adequate protection of the<br/>consumer.

Keywords

vi; OTA; toxina; Metabòlits vegetals; fongs Aspergillus i Penicillium; Aspergil·lus; consumidors

Subjects

633 - Field crops and their production

Knowledge Area

Microbiologia d'Aliments

Documents

Tbmn10de18.pdf

366.4Kb

Tbmn11de18.pdf

870.5Kb

Tbmn12de18.pdf

1.334Mb

Tbmn13de18.pdf

1.901Mb

Tbmn14de18.pdf

372.8Kb

Tbmn15de18.pdf

43.32Kb

Tbmn16de18.pdf

19.81Kb

Tbmn17de18.pdf

265.6Kb

Tbmn18de18.pdf

32.28Kb

Tbmn1de18.pdf

31.20Kb

Tbmn2de18.pdf

44.66Kb

Tbmn3de18.pdf

20.59Kb

Tbmn4de18.pdf

17.18Kb

Tbmn5de18.pdf

20.34Kb

Tbmn6de18.pdf

61.30Kb

Tbmn7de18.pdf

27.32Kb

Tbmn8de18.pdf

33.51Kb

Tbmn9de18.pdf

19.51Kb

 

Rights

ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.

This item appears in the following Collection(s)