Obtención y caracterización de mutantes funcionales del gen frataxin homologue (FH) en Drosophila.

Author

Navarro Langa, Juan Antonio

Director

Moltó Ruiz, Mª Dolores

Date of defense

2005-12-14

ISBN

8437064708

Legal Deposit

V-4747-2006



Department/Institute

Universitat de València. Departament de Genètica

Abstract

La ataxia de Friedreich es una enfermedad humana neurodegenerativa y de herencia<br/>autonómica recesiva. Es la ataxia hereditaria más común en la población caucásica. La<br/>enfermedad está causada por la deficiencia de la proteína frataxina. Las claves sobre la<br/>función de la frataxina provienen de los diferentes estudios llevados a cabo en varios<br/>organismos modelo. Se han aislado los genes ortólogos en un número elevado de<br/>organismos desde bacterias al ratón y también en plantas. En nuestro laboratorio se ha<br/>aislado el gen de Drosophila que codifica para la proteína frataxina, el gen fh.<br/>Drosophila ha resultado ser un excelente modelo para el estudio de enfermedades<br/>humanas dado que son muchos los procesos biológicos conservados entre la mosca y el<br/>hombre, como por ejemplo, la formación y degeneración del sistema nervioso, la<br/>generación y función del corazón, el metabolismo mitocondrial, etc.En este trabajo se<br/>ha abordado el estudio de la función del gen fh en D. melanogaster empleando tres de<br/>las múltiples estrategias existentes en este organismo orientadas a la obtención de<br/>fenotipos mutantes: la movilización de elementos transponibles P, el sistema ARNi y la<br/>sobreexpresión. Con los experimentos de mutagénesis insercional no se obtuvieron los<br/>resultados esperados debido a que el gen fh es un gen pequeño localizado en una región<br/>rica en genes y flanqueado por dos e incluso tres puntos calientes de inserción. Se<br/>abordó entonces una segunda aproximación consistente en el uso del sistema UASGAL4<br/>para el desarrollo de experimentos de sobreexpresión e interferencia. La<br/>interferencia o la sobreexpresión del gen fh en los tejidos de Drosophila equivalentes a<br/>aquellos afectados en los pacientes (sistema nervioso periférico, músculo y corazón) y<br/>en el desarrollo embrionario de Drosophila, inducen la aparición de letalidad, de alguna<br/>alteración fenotípica o de alguna modificación del comportamiento. Los defectos<br/>encontrados se concentran por una parte en el SNP, tanto en las neuronas y axones del<br/>comportamiento sensorial, como en los axones motores embrionarios. En esta caso las<br/>neuronas motoras no parecen afectadas, aunque la sobreexpresión y la intereferencia en<br/>estas estructuras si que han inducido defectos en el adulto. Por otra parte, se han<br/>observado alteraciones importantes en varios de los derivados del mesodermo<br/>embrionario, como son el músculo somático y las células cardiacas y pericardiacas.<br/>Todos estos defectos conducen a la aparición de 100% de letalidad antes de la emersión<br/>del adulto o a una disminución de la capacidad de supervivencia y escalada en los casos<br/>en los que se obtiene descendencia. La interferencia y la sobreexpresión en el músculo<br/>sólo han resultado efectivas si la alteración se produce en los primeros momentos del<br/>desarrollo de las estructuras afectadas. Por su parte, en el SNP sólo se han producido<br/>daños cuando se han afectado conjuntos de precursores sensoriales o de neuronas<br/>sensoriales recién diferenciadas, que participan en la formación de los órganos<br/>sensoriales en el embrión y en el adulto. Pero al parecer, la función de fh no es igual de<br/>importante en todos los órganos sensoriales, ya que la modificación de su expresión en<br/>los órganos cordotonales no parece producir ningún efecto significativo, aunque es<br/>posible que sea debido a que las funciones que desarrollan también son realizadas por<br/>las neuronas multidendríticas.<br/>Todos los resultados descritos permiten establecer un modelo, en D. melanogaster, para<br/>el estudio de la ataxia de Friedreich.


Friedreich ataxia is a severe autosomal recessive disease characterized by<br/>neurodegeneration, cardiomyopathy, and diabetes, resulting from reduced synthesis of<br/>the mitochondrial protein frataxin. It is the most common ataxia among the caucasian<br/>population. The research developed in in patient cells and model organisms such as<br/>yeast, worm, fruitfly and mouse have suggested several hypotheses on the frataxin<br/>function, but the full physiology of frataxin in mitochondria has not been well<br/>established yet. In our laboratory, the Drosophila frataxin gene (fh) was isolated. Very<br/>recently Drosophila has become an excellen model to study human diseases given that<br/>humans and flies have in common the most important biological processes, for example<br/>development and degeneration of nervous system, heart development, mitochondrial<br/>metabolic pathways, etc... In this work, we have carried out the study of the Drosophila<br/>frataxin function using three strategies: insertional P element mutagenesis, RNAi<br/>system and overexpression. The insertional mutagenesis was unsuccessful because fh is<br/>a small gene that lies in a crowed genomic region and is surrounded by two and even<br/>three insertional hotspots. Then we began to use a second approach based on the<br/>generation of transgenic flies overexpressing and reducing the Drosophila frataxin<br/>homolog gene by means of the UAS-GAL4 system. Full lethality, phenotypic alterations<br/>or misbehaviours (climbing deficits and shortened life span) were achieved when this<br/>gene was overexpressed or knocked down in a general or mesodermal patterns and in<br/>the PNS (the most affected tissues in the patients) due to the appearance of<br/>developmental defects in muscle, heart and nervous system. Our results showed that<br/>both an excess or a reduction of frataxin expression disturb development of muscular<br/>and nervous systems in Drosophila. As in humans, the damages are mainly focused on<br/>the Drosophila peripheral nervous elements (sensory and motor axons and neurons).<br/>Moreover, important defects have also been observed in mesodermic derivates such as<br/>somatic muscles, cardial and pericardial cells. However, the defects have only been<br/>provoked when the misexpression was carried out in the earlier stages of muscle and<br/>nervous system development.<br/>All these data together suggest that D. melanogaster could be an appropiate model<br/>organism to study Friedreich ataxia.

Subjects

575 - General genetics. General cytogenetics

Knowledge Area

Facultat de Químiques

Documents

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