Replication stress: mechanisms and molecules involved in DNA replication progression and reinitiation

Abstract

This thesis investigates the mechanisms that are activated in response to replication stress induced with hydroxyurea, an agent that causes deoxyribonucleotides depletion and arrest cells in S phase, in the non-transformed hTERT-RPE cells. The results obtained in the non- transformed cells are compared with the ones obtained with HCT116 colorectal cancer cells.

Previous results indicated that, in response to an acute replication stress in hTERT-RPE, replication forks were able to restart without generating genomic instability, while in response to severe replication stress APC/CCdh1 was activated in S phase, which prevented the reinitiation of replication due to the inactivation of new origins.

In this thesis we verified that, in response to an acute replication stress in hTERT-RPE cells, replication forks undergo fork remodelling, although CMG complexes maintain their integrity and can be reused to restart replication once replication stress is eliminated.

In response to a prolonged replication stress, the lack of APC/CCdh1 activation in S phase in HCT116 tumour cells allows the resumption of replication by the activation of new origins, despite the acquisition of genomic instability during this process.

The role of some proteins, RAD51 and OZF, in replication fork progression or restart during replication stress conditions is also examined. During a mild replication stress, RAD51 and OZF are important for replication fork progression in hTERT-RPE cells. At the same time, they are necessary for the correct progression of replication forks in HCT116 cells, which present a higher basal replication stress, even under unperturbed conditions. In response to an acute replication stress, RAD51 is also important for an efficient replication fork restart and progression in hTERT-RPE cells.

Understanding the mechanisms that are working on non-transformed cells in replication stress, and comparing them with tumour cells, can help us to understand the alterations that tumour cells have acquired in order to bypass these regulations and to discover new molecules relevant to deal with replication stress.

En aquesta tesi s’investiga sobre els mecanismes que s’activen en resposta a un estrès de replicació induït amb hidroxiurea, un agent que causa una depleció de desoxiribonucleòtids a la cèl·lula generant una aturada de la replicació de l’ADN, en les cèl·lules no transformades hTERT-RPE i es comparen els resultats amb els obtinguts en les cèl·lules de càncer colorectal HCT116.

Resultats previs indicaven que, en resposta a un estrès de replicació agut en les cèl·lules hTERT-RPE, les forquetes de replicació eren capaces de reiniciar sense generar inestabilitat genòmica, mentre que en resposta a un estrès sever s’activava l’APC/CCdh1 en la fase S del cicle cel·lular, el qual impedia el reinici de la replicació degut a la inactivació de nous orígens de replicació.

En aquesta tesi s’ha comprovat que, en resposta a un estrès de replicació agut, les forquetes de replicació de les cèl·lules hTERT-RPE pateixen dos tipus de remodelació, tot i que els complexes CMG mantenen la seva integritat i poden ser reutilitzats per reiniciar la replicació una vegada l’agent causant de l’estrès sigui eliminat.

En resposta a un estrès de replicació prolongat, la falta d’activació de l’APC/CCdh1 en la fase S de les cèl·lules tumorals HCT116 permet el reinici de la replicació per l’activació de nous orígens, malgrat l’adquisició d’inestabilitat genòmica.

També s’indaga sobre la funció d’algunes proteïnes, RAD51 i OZF, en la progressió o reinici de les forquetes de replicació en condicions d’estrès de replicació. Durant un estrès de replicació suau, RAD51 i OZF són importants per la progressió de la forqueta en les cèl·lules hTERT-RPE. A la vegada, resulten necessàries per la correcta progressió de la forqueta de replicació en condicions no pertorbades de les cèl·lules tumorals HCT116, les quals presenten un estrès de replicació basal més alt que les cèl·lules hTERT-RPE. Finalment, RAD51 també resulta important pel correcte reinici i progressió de la forqueta de replicació en les cèl·lules hTERT-RPE després d’un estrès de replicació agut.