Mecanismes de toxicitat de la dopamina en cèl·lules de neuroblastoma humà SH-SY5Y

Abstract

La malaltia de Parkinson és una de les malalties neurodegeneratives humanes més freqüents, especialment en pacients d'edat avançada amb una simptomatologia provocada especialment per la manca de DA. La gènesi d'aquesta malaltia no és clara, si bé sembla haver un component genètic en un nombre reduït dels casos diagnosticats, la principal causa roman encara desconeguda. La hipòtesi neurotòxica està present des de fa molt temps i el que sembla més lògic és pensar en l'existència d'una condició mixta, es a dir, una predisposició genètica (congènita, heretada o adquirida) i un detonant que podria ser endogen o exogen. <br/><br/>Diverses evidencies suggereixen un paper important de la dopamina en el dany neuronal observat durant la malaltia, per aquest motiu, mitjançant diversos experiments, el nostre laboratori ha determinat els efectes de diferents concentracions de dopamina (DA) sobre la viabilitat de les cèl·lules SH-SY5Y. <br/><br/>El primer que s'ha fet es comprovar que la DA s'acumula dins la cèl·lula i aproximadament a quines concentracions ho fa. La DA entra ràpidament dins la cèl·lula, on arribarà a unes concentracions inferiors però properes a les utilitzades extracel·lularment.<br/><br/>El primer pas dins de la toxicitat produïda per la DA sembla clarament implicar la seva oxidació intracel·lular. Totes les alteracions produïdes per la DA s'han bloquejat amb antioxidants d'acció intracel·lular com la N-acetilcisteïna. Així doncs, per garantitzar que la DA no sigui tòxica, cal que no s'oxidi. <br/><br/>És difícil precisar si la toxicitat de la DA pot estar vinculada al seu procés d'oxidació o als metabòlits reactius que es produeixen. En el primer cas la DA, a l'oxidar-se, està donant lloc a peròxid d'hidrogen i, per tant, a un potencial estrès oxidatiu. En les nostres cèl·lules, l'augment de peroxidació per efecte de la DA és relativament suau, a menys que s'incorpori Fe3+ en el medi com a catalitzador d'aquest procés. En el segon cas s'ha de considerar que la DA està donant lloc a quinones i a aminocroms. Les primeres són prou reactives com per unir-se a grups tiol de forma covalent i per tant, potencialment, poder modificar qualsevol proteïna. Venim a suggerir i en part a demostrar que la DA, oxidant-se a dopaquinona i dopaminocrom, pot reduir-se novament en presència de NADH o NADPH i donar lloc a un cicle redox en el que es pot disminuir considerablement el contingut de la forma reduïda d'aquests coenzims, essencials pel bon funcionament cel·lular. <br/><br/>A part d'aquesta alteració redox, s'han observat altres alteracions com a conseqüència de l'oxidació de la DA. Una de les més primerenques és l'acumulació de proteïnes ubiqüitinitzades. Com a conseqüència d'aquest fet i d'altres mecanismes s'activarien una sèrie de vies que modificarien l'expressió de tota una gama de gens implicats en la transducció de senyals i en mort o supervivència cel·lular com GADD153 i C/EBP-beta així com de l'alfa-sinucleïna. L'acumulació d'alfa-sinucleina, conjuntament amb la de les proteïnes alterades per les quinones i les proteïnes ubiqüitinitzades no degradades pel proteosoma pot afavorir la formació d'agregats de nucleació, amb característiques d'agressoma, que donen lloc a la formació al seu voltant de vacuoles autofàgiques i a l'activació d'un senyal d'estrès reticular. <br/><br/>La DA desencadena doncs clarament i de forma dosi-dependent un procés d'autofàgia en el citoplasma cel·lular. Pensem que la finalitat de l'autofàgia és un cop més la de salvar la cèl·lula, però si l'agressió no s'atura la cèl·lula s'acaba morint per acció de la mateixa autofàgia, o bé mitjançant un procés apoptòtic en alguns casos o simple necrosi en d'altres. <br/><br/>BNIP3 és una proteïna la expressió de la qual també incrementa després del tractament amb DA. BNIP3 ja s'ha descrit anteriorment com factor que s'indueix quan hi ha autofàgia. Un dels factors que la regulen és HIF-1-alfa, factor que s'indueix ràpidament en situacions d'hipòxia o d'estrès oxidatiu i com hem vist després del tractament amb DA. Per tant, la cèl·lula es comporta de forma semi-anaeròbica, de manera que la relació lactat/piruvat augmenta, i com a conseqüència d'aquest fet, els nivells d'AMP han d'estar augmentats, podent-se activar l'AMPK. Aquest procediment per si sol pot explicar l'aturada de la ruta de mTOR observada per part de la DA, sense descartar algun efecte més directe sobre TSC1/TSC2 o Rheb.

<I>"Mechanisms of cell damage triggered by dopamine in SH-SY5Y cells."<br/><br/>TEXT:<br/><br/>Dopamine (DA) could play a central role in neuronal dopaminergic degeneration in Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders. The mechanisms leading to neuronal damage and death are not yet fully understood.<br/><br/>We have used human neuroblastoma SH-SY5Y cells that are sensitive to dopamine, with the aim to further understand the molecular mechanisms through which dopamine may damage the cell. <br/><br/>DA enters the cell in a dose-dependent and saturating way. DA triggers a redox cycle that causes a slight increase in peroxidation (DCFH) and a decrease in the reductive power of the cell that could be assessed by MTT, NADH concentration and GSH/GSSG relationships. Such an effect is reflected in a decrease in cell viability, a decrease in oxygen consumption and an increase in cytosolic calcium concentration. The transcription factors C/EBPß and GADD153/CHOP increase their expression. Parameters of endoplasmic reticulum stress (grp78) are activated and a consistent autophagy is observed using electronic microscopy.<br/><br/>Autophagy is a process characterized by the presence of double or multiple-membrane cytoplasmic vesicles sequestering cytoplasm and organelles such as mitochondria and endoplasmic reticulum.<br/>The genes related with autophagy and their products are currently known as ATG. The microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) (the mammalian orthologue of yeast ATG8) is a useful procedure for autophagy detection. We show that dopamine increases LC3 expression and its proteolysis product LC3-II which is localized in autophagosamal membranes.<br/>The PI3K-AKT-mTOR pathway is involved in autophagy induced by starvation. The activation of S6K (a downstream substrate of mTOR) decreases after incubation with dopamine. This is indicative of a mTOR inhibition by dopamine. 3-Methyladenine blockes autophagy but not the LC3 increase. Beclin 1 (ATG6) is also involved in this process.<br/>Moreover, a multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) showed an increase in BNIP3, NOXA and PUMA expression after DA treatment. BNIP3 and p53 expression were confirmed by WB. BNIP3 is a member of the BH3-only family, which are factors involved in apoptosis and autophagy. Since BNIP3 is induced under hypoxic conditions we studied and found an increase of hypoxia inducible factor (HIF 1alpha) expression, suggesting a hypoxic-like condition caused by dopamine.</I>