Links between chromatin structure and regulation of alternative pre-mRNA splicing in mammalian cells

Abstract

Intron removal is a necessary step for expression of most genes in higher eukaryotes, and alternative splice selection is a highly regulated mechanism that endows a single gene with the possibility to codify for multiple transcripts. Pre-mRNA splicing occurs largely co-transcriptionally, and its outcome is influenced by transcription elongation and chromatin structure. In this thesis we have used two different approaches to study novel links between chromatin structure and alternative splicing regulation.

In the first approach, we identified genome-wide progesterone-regulated cassette exons and compared them with nucleosome density profiles, with the aim of finding correlations between changes in nucleosome positioning and changes in alternative splicing. We find that, even if all exons harbor a well-positioned exonic nucleosome, four different classes of nucleosome density profiles can be identified around alternative exons, which strongly correlate with the DNA sequence GC content. Transitions between these profiles occur upon hormone stimulation and can be correlated with alternative splicing changes, although changes in nucleosome profiles are also observed in non-regulated exons. In particular hormone-induced exon inclusion is more frequently linked to changes in nucleosome density than hormone-induced skipped exons, which tend to have low nucleosome density profiles even before hormone treatment. Peaks of nucleosome density before alternative exons tend to correlate with exon inclusion.

In the second approach, we took advantage of ENCODE data of chromatin epigenetic signatures and RNA-Seq in multiple cell lines to evaluate functional enrichment of histone modifications over alternative exons. We find that three histone modifications (H3K4me3, H3K27ac and H3K9ac) co-occur in a subset of exons when they are highly included. These features are sufficient to predict differential inclusion levels in other cell lines. Moreover, they are enriched in exons characterized by the presence of DNase hypersensitive sites, promoter signatures and RNA Pol II accumulation. These observations suggest a functional role for 3-dimensional genome structure in the regulation of alternative splicing.

La eliminación de intrones es un paso necesario para expresar la mayoría de los genes en eucariotas superiores. La selección alternativa del corte y empalme (pre-mRNA splicing) es un mecanismo altamente regulado que dota a un solo gen con la posibilidad de codificar para múltiples transcritos. El splicing del pre-mRNA se produce en gran parte de manera cotranscripcional y por esto resultado está influenciado por la elongación de la transcripción y la estructura de la cromatina. En esta tesis se han utilizado dos enfoques diferentes para estudiar nuevos vínculos entre la estructura de la cromatina y la regulación del splicing alternativo.

En el primer enfoque hemos identificado, a nivel de todo el genoma, exons internos regulados por progesterona y los hemos comparados con los perfiles de densidad de nucleosomas, con el objetivo de encontrar correlaciones entre los cambios en el posicionamiento de nucleosomas y en el splicing alternativo. Hemos encontrado que, aunque todos los exones albergan un nucleosoma bien posicionado, se pueden identificar cuatro clases diferentes de perfiles de densidad de nucleosomas alrededor de exones alternativos, que se correlacionan fuertemente con el contenido G+C en la secuencia del ADN. Las transiciones entre estos perfiles se producen tras la estimulación con la hormona y se pueden correlacionar con los cambios en splicing alternativo, aunque se observan también cambios en los perfiles de nucleosomas en exones no regulados. La inclusión de exones inducida por la hormona está relacionada más a menudo con cambios en la densidad de nucleosomas que la exclusión. Estos exones excluidos tienden a tener perfiles de baja densidad nucleosomal incluso antes del tratamiento hormonal. Los picos de densidad de nucleosomas antes de exones alternativos tienden a correlacionarse con la exclusión de exones.

En el segundo enfoque nos aprovechamos de los datos de ENCODE de marcas epigenéticas de la cromatina y de RNA-Seq en múltiples líneas celulares, para evaluar el enriquecimiento funcional de las modificaciones de histonas en exones alternativos. Encontramos que tres modificaciones de las histonas (H3K4me3, H3K27ac y H3K9ac) co-ocurren en un subconjunto de exones mas incluidos. Estas características son suficientes para predecir los niveles de inclusión diferenciales de estos exones entre líneas celulares. Además, estos exones se caracterizan también por la presencia de sitios hipersensibles a la DNasa, de marcas de promotores y la acumulación de ARN Pol II . Estas observaciones sugieren un papel funcional para la estructura en 3 dimensiones del genoma en la regulación del splicing alternativo.