Desarrollo y validación de una plataforma optofluídica ultrasensible para la detección especifíca y selectiva de mercadores tumorales en oncología

Abstract

Nowadays cancer is a devastating illness, so its early diagnosis could represent a powerful advantage in the struggle to eradicate it. The most recent technologies allowed the development of sensing platforms that led to the improvement of diagnosis processes, making it possible to detect tumor markers at very low concentrations. However, there are very few applications that measure analytes of clinical interest in real samples with such low concentrations, with the minimum number of pretreatment steps, and with the possibility of performing parallel tests and in real time. To this purpose, in this doctoral work I developed a platform that combines the most recent advances in plasmonics, microfluidics, nanofabrication and surface chemistry to obtain a highly sensitive and specific biosensing device that is able to detect analyte concentrations of a few ng/mL, with the highest precision and accuracy possible. This device is composed of highly-sensitive nanostructured Localized Sufarce Plasmon Resonance (LSPR) sensors integrated in the microchannels of a microfluidic chip. This Lab-on-a-Chip (LOC) is integrated in an optical platform that allows us to monitor the signals coming from the biorecognition processes that take place on the surface of the LSPR sensors. These sensors are functionalized with a highly selective chemistry that allows the immobilization of the receptors that will detect specifically and selectively the analytes we are interested in. Regarding the sensor, we describe the nanofabrication technique used to build the sensor as well as the study of different systems and the tests that led to choose an ensemble of gold nanorods as the ultra-sensitive sensing element of the platform. We list all the steps we followed in the preparation of the microfluidics devices and the operation protocols of the final LOC. Lastly, we present a wide study, even though preliminar, of different functionalization methodologies to anchor the receptor. We initially performed optimizations and a proof-of-principle test by using an antibody system whose interaction is known as it is an IgC/anti-IgC system for both methodologies. We chose the optimal chemistry based on these results to apply it in the preliminary studies for the detection of tumor markers of high relevance for different types of cancer, such as the prostate-specific antigen (PSA), the alpha-fetoprotein (AFP) and other systems of interest. The obtained results are really promising, as we can detect and quantify these analytes in a very precise way with very low concentration (few ng/mL) in complex matrices like human serum. The platform allows us to detect concentrations and obtain levels of quantification that are comparable to the normal values for blood reported for the analysed systems: this guarantees a promising future for early diagnostics in such systems. Furthermore, we validated these results with techniques, like ELISA, that are widely used for these kind of studies. The work described in this doctoral thesis is an important and big advance in the development of a new generation of ultra sensitive tools that allow the early detection of very low concentrations of tumor markers: this represent an important progress in cancer diagnosis and treatment, as a consequence, a big step forward towards its complete eradication.

El cáncer constituye hoy en día una enfermedad devastadora, cuyo diagnostico precoz representaría una poderosa ventaja en los tratamientos para erradicarla. Las más recientes tecnologías, han permitido el desarrollo de plataformas de sensado que han permitido ir mejorando los procesos de diagnósticos, pudiendo detectar concentraciones de marcadores tumorales, a una muy baja concentración, sin embargo no existen muchas aplicaciones que midan analitos de interés clínico en muestras reales a estos niveles, con los mínimos pasos de pretratamiento y con la posibilidad de realizar ensayos paralelos y en tiempo real. En este sentido, en este trabajo doctoral, se ha desarrollado una plataforma que combina los últimos avances en plasmónica, microfluídica, nano-fabricación y química de superficie para obtener finalmente un dispositivo de biosensado altamente sensible y específico capaz de detectar concentraciones de analitos de unos pocos ng/mL, con la mayor precisión y exactitud posibles. Este dispositivo está conformado por sensores LSPR nanoestructurados altamente sensibles, integrados en microcanales de un chip microfluídico. Este Lab-on-a-Chip (LOC), está integrado con una plataforma óptica que permite el monitoreo de las señales provenientes de los procesos de bioreconocimiento que se dan lugar sobre la superficie de los sensores LSPR. Estos sensores están funcionalizados con una química altamente selectiva que permite la inmovilización de los receptores que detectarán específica y selectivamente a los analitos de interés. Para el caso del sensor, se describe el método de nano-fabricación empleado así como también el estudio de diversos sistemas y los ensayos que llevaron finalmente a escoger un conjunto de Nanocilindros de oro como elemento sensor ultrasensible de la plataforma. Así mismo todos los pasos seguidos en la elaboración de los dispositivos microfluídicos y los protocolos de operación del LOC final. Por último se presenta un amplio estudio, aunque preliminar, de diversas metodologías de funcionalización para el anclaje del receptor. Se realizarón inicialmente optimizaciones y la prueba de concepto empleando un sistema de anticuerpos cuya interacción es conocida como lo es un sistema IgG/anti-IgG para ambas metodologías. Finalmente basados en esos resultados, se eligió la química más óptima para la aplicarla en los estudios iniciales para la detección de marcadores tumorales de gran relevancia relacionados con diversos tipos de cáncer, como el antígeno específico de Próstata (PSA), la alfafeto proteína (AFP) y otros sistemas de interés. Los resultados alcanzados son realmente prometedores, llegando a poder detectar y cuantificar estos analitos de manera muy precisa en muy bajas concentraciones (del orden de pocos ng/mL) en matrices complejas como el suero humano. Las concentraciones que se pudieron detectar y los límites de cuantificación obtenidos con la plataforma están al nivel de los valores normales en sangre reportados para los sistemas estudiados, lo que representa un futuro prometedor en el diagnóstico precoz de los mismos. Así mismo estos resultados fueron validados empleando técnicas como ELISA, que representa una técnica universal ampliamente utilizada en este tipo de estudios.El trabajo realizado en esta tesis doctoral finalmente constituye un importante y gran avance en el desarrollo de nuevas herramientas de última generación ultrasensibles que permitan la detección temprana de muy bajas concentraciones de marcadores tumorales que van asociados al cáncer, constituyendo un importante avance en el diagnóstico de la enfermedad y por ende en los tratamientos existentes que pudiesen erradicarla por completo.