Clonación y caracterización de un nuevo tipo de proteína fosfatasa en levadura

Abstract

Fragmentos de DNA que contiene características estructurales encontrados en Ser /Thr proteínas fosfatasas fueron amplificados mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir de DNA genómico de levadura. La amplificación se llevó a cabo mediante el uso de oligonucleótidos degenerados correspondientes a secuencias conservadas en las proteínas fosfatasas de tipo 1, 2A y 2B. Un fragmento de amplificación de 215 pares de bases se utilizó para un rastrear una biblioteca de DNA genómico seleccionada por tamaño. Se identificó un clon positivo que se aisló y secuenció. La secuencia de nucleótidos revela un ORF de 2076 pares de bases que codifica una proteína de 692 aminoácidos, a la que hemos denominado Ppz1. La mitad carboxi-terminal de esta proteína está estructuralmente relacionada con la fosfatasa de tipo 1, mientras que la mitad amino-terminal de la mitad de la proteína no está relacionada con las secuencias encontradas en otras proteínas fosfatasas. Esta región es muy rica en residuos de Ser y presenta un elevado número de aminoácidos básicos. Este producto génico representa una nueva clase de proteína fosfatasa en base a su singular estructura. El gen PPZ1, que está situado en el cromosoma XIII, se transcribe como un mRNA de aproximadamente 2,7 kilobases, y se ha encontrado que su cantidad aumenta de 3 a 4 veces a lo largo del cultivo. Hemos generado anticuerpos contra Ppz1 e identificado el producto génico de PPZ1 por análisis de inmunoblot a partir de extractos celulares como una proteína de 75-kDa. La cantidad de la proteína inmunoreactiva aumentó en las células que llevaban varias copias del gen. La interrupción del gen a dado lugar a células viables, sin detectarse cambios fenotípicos, lo que indica que el gen PPZ1 no es esencial para el crecimiento. Los experimentos de Southern blot preliminares en condiciones de baja estringencia han puesto de manifiesto la existencia de una secuencia genómica relacionada con PPZ1, a la que denominamos PPZ2.

DNA fragments containing structural characteristics found in Ser/Thr protein phosphatases were amplified by polymerase chain reaction from yeast genomic DNA. Amplification was carried out by using degenerate oligonucleotides encoding conserved sequences found in type 1, 2A, and 2B phosphatases. A 215-base pair amplification fragment was used to screen a size-selected library of genomic DNA. A positive clone was isolated and sequenced. Its nucleotide sequence reveals a 2076-base pair ORF encoding a 692-aminoacid protein that we called Ppz1. The carboxy-terminal half of this protein is structurally related to type I phosphatases, whereas the amino-terminal half of the protein is unrelated to sequences found in other protein phosphatases. This region is very rich in Ser residues and presents a high number of basic amino acids. Therefore, the gene product, on the basis of its unique structure would represent a novel class of protein phosphatase. The PPZ1 gene, which is located at chromosome XIII, is transcribed as an mRNA of about 2.7 kilobases and the amount of message has been found to increase 3- to 4- fold during the culture. We raised antibodies against Ppz1 and identified the PPZ1 gene product by immunoblot analysis of cell extracts as a 75-kDa protein. The amount of the immunoreactive protein was increased in cells carrying multiple copies of the gene. Disruption of the gene resulted in viable cells, with no detectable phenotypic change, indicating that the gene is not essential for growth. Preliminary Southern blot experiments at low stringency revealed the existence of a genomic sequence related to PPZ1 that we called PPZ2.