Biomimetic hydrogels for in situ bone tissue engineering : nature-inspired crosslinking methods as a tool to tune scaffold physical properties

Abstract

The global incidence of bone fractures, and subsequently that of non-healing ones, is expected to rise in the coming decades, mostly due to an increased risk of age-related conditions. Currently, the biomaterials field is moving towards the design of scaffolds mimicking the cell microenvironment to guide stem cells differentiation and recapitulate the development of target tissues. Biomimicry is a wide concept and several approaches have been adopted to produce cellinstructive scaffolds. Herein, we have explored the use of citric acid and lysyl oxidase, both of them related to bone nanostructure and mechanical performance, to develop scaffolds resembling the extracellular matrix of developing bone. First, elastin-like recombinamers (ELRs) hydrogels were achieved through a one-step chemical crosslinking reaction with citric acid, a molecule currently considered to be essential for the proper performance of bone tissue. By systematically studying the crosslinking reaction and its contribution to hydrogel properties, we were able to control the architecture and stiffness of citric acid-crosslinked hydrogels while preserving the integrity of adhesion sequences in ELRs. Interestingly, the use of citric acid conferred so-produced hydrogels the ability to nucleate calcium phosphate. Mechanically-tailored citric acid-crosslinked hydrogels were shown to be able to support the growth of human mesenchymal stem cells and to lead to seemingly biocompatible degradation products. Despite in vitro differentiation studies weren¿t conclusive as to their osteogenic potential, both mechanically-tailored and non-tailored citric acid-crosslinked hydrogels were shown to integrate into bone and to be partially degraded upon implantation in critical size defects in mouse calvaria. Despite cell invasion in mechanically-tailored scaffolds was seemingly lower than in non-tailored counterparts, both types of matrices allowed the formation of bone tissue, by intramembranous ossification, to a similar extent by the end of the study. At the time points selected for the in vivo study, both tailored and non-tailored hydrogels were found to be osteoconductive; osteoinduction was not observed in any of the cases. Mechanically-tailored hydrogels not being seemingly superior to control matrices at selected time points could to be due to (i) a high surface polymer density hindering cell invasion and thus delaying osteoinduction, or to (ii) a non-osteoinductive combination of properties (chemical + physical) despite hydrogels possessing theoretically osteoinductive stiffness. These results point out that scaffolds must be seen as a whole given the high complexity of the in vivo cell niche, whose signals act synergistically to define cell behavior. Thus, more complex designs are required if recapitulation of bone development is to be targeted. Additionally, recombinant lysyl oxidase (LOX) from human aorta was successfully produced in Escherichia coli to high purity. Despite achieving LOX with copper cofactor amounts and activity higher than those found in the literature, overall activity was low and the insolubilization of ELRs was not achieved, suggesting that novel expression and purification systems not compromising enzymatic activity are required if LOX is to be used to produce scaffolds.

S'espera que la incidència global de fractures òssies, i per extensió la d'aquelles que no són capaces de consolidar per si soles, augmenti en les pròximes dècades, principalment degut a l'increment del risc de patologies associades a l'envelliment. Actualment, el camp dels biomaterials es mou cap al disseny de bastides que mimetitzen el microambient cel·lular per tal de guiar la diferenciació de cèl·lules mare i recapitular el desenvolupament de teixits diana. El biomimetisme és un concepte ampli i diverses aproximacions han sigut dutes a terme per tal de produir bastides capaces de guiar el comportament cel·lular. En aquesta tesi hem explorat l'ús d'àcid cítric i l'enzim lisil oxidasa, ambdós relacionats amb la nanoestructura i propietats mecàniques del teixit ossi, per desenvolupar bastides que mimetitzin la matriu extracel·lular de l'os en desenvolupament. En primer lloc, es va produir hidrogels basats en polímers recombinants de tipus elastina (Elastin-like recombinamers; ELRs) mitjançant una reacció d'entrecreuament en un pas amb àcid cítric, una molècula actualment considerada una peça essencial per l'adequat funcionament mecànic del teixit ossi. Havent fet un estudi sistemàtic de la reacció d'entrecreuament i de la seva contribució a les propietats dels hidrogels, vam ser capaços de controlar l'arquitectura i la rigidesa de les bastides entrecreuades amb àcid cítric, tot preservant la integritat de les seqüències d'adhesió cel·lular contingudes als ELRs. És interessant remarcar que l'ús d'àcid cítric com agent entrecreuant conferí als hidrogels capacitat de nucleació de fosfats de calci. Es va demostrar que els hidrogels entrecreuats amb àcid cítric i amb propietats mecàniques diana permeten el creixement de cèl·lules mare mesenquimals humanes i donen lloc a productes de degradació aparentment biocompatibles. Tot i que els estudis de diferenciació in vitro no van ser concloents pel que fa al potencial osteogènic d'aquestes bastides, tant les matrius amb propietats mecàniques diana com aquelles control van ser capaces d'integrar-se amb l'os natiu i van ser parcialment degradades un cop implantades en defectes de mida crítica en calotes de ratolí. Tot i que la invasió cel·lular en hidrogels amb propietats mecàniques diana va ser inferior en comparació amb l'observada en bastides control, ambdós tipus de matrius van permetre la formació d'os nou, mitjançant ossificació intramembranosa, en quantitats similars al final de l'estudi. Als punts temporals seleccionats, ambdós tipus de bastides van demostrar ser osteoconductives, però no es va observar evidències d'osteoconducció en cap cas. El fet que les bastides amb propietats mecàniques diana no fossin superiors a les matrius control pel que fa a formació òssia, podria ser degut a (i) a una elevada densitat superficial que hauria dificultat la invasió cel·lular i retrassat l'osteoinducció, o (ii) a una combinació de propietats (químiques + físiques) no osteoinductiva tot i que les bastides posseïen una rigidesa teòricament osteoinductiva. Aquests resultats demostren que les bastides han de ser vistes com un tot donada l'elevada complexitat del nínxol de cèl·lules mare in vivo, les senyals del qual actuen de forma sinèrgica per definir el comportament cel·lular. Així, és necessari assolir bastides amb un nivell de complexitat més elevat per tal de recapitular el desenvolupament ossi. Addicionalment, es va produir lisil oxidasa (LOX) d'aorta humana en forma recombinant a elevada puresa a partir de cultius d'Escherichia coli. Tot i que es va aconseguir produir LOX amb un contingut del cofactor coure i una activitat superiors a aquells trobats en la literatura, l'activitat de l'enzim va ser generalment baixa i no es va assolir la insolubilització d'ELRs. Això evidencia la necessitat de desenvolupar nous sistemes d'expressió i purificació de l'enzim per tal que aquest pugui ser aplicat a la producció de bastides.