Ribonucleotidil reductases bacterianes: estudi enzimàtic, genètic i evolutiu

Abstract

Les Ribonucleotidil Reductases (RNR) són metal·loenzims que catalitzen la reducció dels ribonucleòtids (NTP) als seus corresponents desoxiribonucleòtids (dNTP), que són els monòmers principals per a la síntesi del DNA. S'han descrit tres classes de RNR (I, II i III) atenent la seva estructura, metall, radical i cofactors necessaris per a la síntesi del DNA.<br/>En aquest treball s'ha dut a terme l'estudi de diverses RNR bacterianes pertanyent a les tres classes d'RNR des del punt de vista enzimàtic, genètic i evolutiu.<br/>Les RNR de classe III (NrdDG) tant sols són actives en condicions d'anaerobiosis estricta, estudiant-se en Escherichia coli i Lactococcus lactis. En ambdós casos mutants pels gens nrdD i nrdG, resulten ser imprescindibles en condicions d'anaerobiosi estricta. La sobreexpressió i purificació de les proteïnes NrdDG de Ll ha posat de manifest que la reducció dels NTPs es du a terme en dos etapes, una primera produint-se l'activació de NrdD i una segona on es produeix la reducció del ribonucleòtid. Per primera vegada s'ha observat que la unió de l'ATP segueix una cinètica sigmoidal amb un alt grau de cooperativitat entre els dos llocs involucrats en la regulació al·lostèrica de l'enzim.<br/>Les RNR de classe II (NrdJ) s'han purificat i seqüenciat els seus gens en bacteris filogenèticament primitius com Thermotoga maritima i Deinococcus radiodurans presentant aquestes proteïnes, tots els aa relacionats en la regulació al·lostèrica i activitat catalítica. Podem hipotitzar que ha d'existir una gran relació estructural entre les proteïnes d'aquesta classe amb les de classe I. El gen nrdJ de Dr presenta una inteïna en l'extrem 5' que es processada durant la traducció del gen i absent en la proteïna madura.<br/>En els anys 80 es va caracteritzar parcialment la RNR de Corynebacterium ammoniagenes assignant-la a una nova classe (IV), ja que depenia la seva activitat de manganès. En aquest treball hem purificat i seqüenciat la RNR activa, classificant aquesta RNR la ja descrita classe Ib (nrdHIEF). L'anàlisi transcripcional d'aquesta regió demostra l'existència de dos promotors independents pels trànscrits nrdHIE i pel nrdF. Mitjançant RT-PCR semiquantitativa es va detectar la presència de 10 vegades més trànscrit nrdF que de nrdHIE. Aquests gens veuen incrementada la seva expressió en presència d'hidroxiurea, peròxid d'hidrogen y de manganès en el medi, involucrant d'aquesta manera un possible paper de reguladors transcripcionals que regulen el cicle cel·lular, FUR/DtxR y per reguladors que responen a l'estrès oxidatiu.<br/>Per primera vegada s'ha observat l'existència de les tres classes de RNR (I, II i III) en un mateix organisme com passa en Pseudomonas aeruginosa, detectant-se l'expressió simultània de les RNR de classe I i II.<br/>L'estudi filogenètic i evolutiu a partir d'un alineament de totes les seqüències proteiques disponibles en la base de dades revela que la RNR més ancestral és la classe III que per divergència evolutiva hauria donat lloc a la classe II i posteriorment a la classe I.

Deoxyribonucleotides (dNTP) are synthesized in all organisms from ribonucleotides (NTP), in a reaction catalyzed by the enzyme Ribonucleotide Reductase (RNR). There are three classes of RNR that differ in their protein structure. All operate via a free radical mechanism involving protein radicals but differ in the way in which the protein radical is generated. Class I enzymes require oxygen and are coded either by the nrdAB genes (class Ia) or nrdEF genes (class Ib). Class II enzymes are independent of oxygen and depend on adenosyl cobalamin (B12). Class III enzymes are poisoned by oxygen and are coded by the nrdD and nrdG genes.<br/>In the present work we studied diverse RNR classes from different bacterial species from the enzymatic, genetic and evolution point of view.<br/>We show that knock-out mutants of either nrdD and nrdG from E. coli and L.lactis were essential during anaerobic growth. <br/>The LL nrdD and nrdG were sequenced, cloned and overproduced in E. coli. NrdD and NrdG catalyze the reduction of NTP to the corresponding dNTP in the presence of SAM, a reducing system, potassium ions, DTT and formate. EPR experiments demonstrated a [4Fe-4S] cluster in NrdG and a glycyl radical in NrdD. Allosteric effectors bound to two separate sites on NrdD. The two sites showed an unusually high degree of cooperativity.<br/>RNR from the ancient eubacteria, Thermotoga maritima, Deinococcus radiodurans and Chloroflexus. aurantiacus were found to belong a class II enzyme. TM and DR genes were cloned by PCR using peptide sequence information. From the conservation of substrate- and effector-binding residues between class I and this class II sequences we propose that class II enzymes contain a similar 3D structure in the active site.<br/>We have purified the active RNR of Corynebacterium ammoniagenes, (CA) previously claimed to represent a fourth RNR class. Peptide and gene sequence analyses clearly indicate that the active RNR is a generic class Ib enzyme, with a diferric metal cofactor.<br/>Transcriptional analysis of this nrd region shows the presence of three different mRNA (nrdHIE, nrdF and the ORF). Presence of manganese in the medium stimulate the transcription of both nrdHIE and nrdF genes through a DtxR-like system. Furthermore, oxidative stress and hidroxiurea induce the expression of these genes. <br/>Surprisingly, the genomic sequence of Pseudomonas aeruginosa (PA) contains sequences for each of the three classes. Extracts from PA grown aerobically or microaerobically contain active class I and II enzymes simultaneously. <br/>The occurrence of the different classes among species of the g-Proteobacteria. Class III are present in all species tested, but the presence of the other classes varies. <br/>Phyllogenetic analyse of all known RNR sequences support the hypothesis that the three RNR classes diverged from a common ancestor currently represented by the anaerobic class III.