Diversidad del picoplancton eucariótico marino mediante métodos moleculares

Abstract

Los picoeucariontes que, junto con los procariontes heterotróficos y fototróficos, forman el picoplancton, pueden constituir una parte importante de la biomasa del mismo e incluso de todo el sistema. Su contribución a la producción primaria del ecosistema es también muy significativa. Pero hasta el momento la diversidad de la fracción eucariótica que forma la comunidad picoplanctónica marina era muy desconocida.<br/>La identificación de la fracción eucariótica del picoplancton en comunidades naturales es a menudo una tarea difícil, debido a su similar morfología y pequeño tamaño (< 5 mm). Algunos de ellos pueden ser discriminados a nivel de Clase mediante microscopía electrónica o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), pero en la mayoría de los casos no es posible hacer una identificación a más bajos niveles taxonómicos. Por otro lado, solo un pequeño porcentaje de estas especies picoplanctónicas puede crecer en cultivo, y además no hay garantía de que estos organismos aislados en cultivo sean los dominantes en la comunidad natural.<br/>La aproximación por técnicas moleculares basadas en análisis filogenéticos de secuencias de rRNA tales como la clonación y secuenciación, y técnicas de fingerprinting como la Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) o la Terminal Restriction Fragemnt Length Polymorphism (T-RFLP), han sido una alternativa que nos ha permitido caracterizar con más detalle la diversidad del picoplancton eucariótico en muestras naturales de diferentes sistemas marinos. Se ha muestreado una gran variedad de sistemas, desde mar abierto a zonas costeras, gracias a diferentes campañas oceanográficas: Mar de Weddel-Scotia (campaña DOVETAIL; Paso Drake (campaña DHARMA); Atlántico Norte (campaña ACSOE-NAE); Mar de Alborán (campaña MATER´97, 98 y 99). En ellas se obtuvieron muestras que abarcaban tanto la variabilidad espacial como la variabilidad temporal de las comunidades del picoplancton eucariótico marino.<br/>Gracias a la realización de bibliotecas genéticas de algunas de estas muestras (pertenecientes a la Antártida, al Mar de Alborán y al Atlántico Norte), mediante secuenciación y comparación con el banco de datos, se obtuvo información acerca de la diversidad de los grupos filogenéticos presentes en estos diferentes ambientes. Los resultados mostraron una elevada diversidad filogenética incluyendo muchos grupos taxónomicos diferentes y miembros de grupos filogenéticos distantes. La mayoría de estos grupos taxónomicos se afiliaban a organismos conocidos del picoplancton eucariótico fototrófico como las prasinofíceas, que fueron las más representadas, así como también las primnesiofíceas. Otra fracción, menos frecuente, pudo afiliarse a grupos claramente heterotróficos tales como ciliados, algunas crisofíceas, cercomonadales y hongos. Pero también apareció otro elevado número de secuencias distintas a cualquier secuencia conocida y que correspondían a nuevos linajes tales como los nuevos estramenópilos y los nuevos alveolados. Estos nuevos linajes aparecieron ampliamente distribuidos tanto filogenética como geográficamente. Algunos de ellos pueden constituir una fracción importante de los microorganismos heterotróficos y jugar un papel crucial en la red trófica microbiana.<br/>Técnicas de fingerprinting como la DGGE y la T-RFLP, fueron usadas para el estudio en paralelo de la diversidad de picoeucariontes en estas muestras marinas. Gracias a la optimización de la DGGE usando cebadores específicos para amplificar un fragmento del gen rRNA 18S de eucariontes, se pudo estudiar la diversidad y variabilidad a gran escala, de una manera detallada, de las comunidades del picoplancton eucariótico marino presentes en muestras de la Antártida y del Mar de Alborán. Esto nos permitió observar cambios en su distribución y composición no sólo a lo largo de gradientes verticales, sino en relación con escalas espaciales y temporales.

Picoeukaryotes together with the heterotrophic and phototrophic prokaryotes, constitute the picoplankton. Picoeukaryotes can contribute an important part the picoplankton biomass and even to the total biomas of the system. Also, their contribution to the primary productivity of the ecosystem is very significant. However, very little is known about the diversity of the eukaryotic fraction of the marine picoplanktonic assemblages. <br/>The identification of picoeukaryotes in natural communities is difficult, principally due at their similar morphology and small size (< 5 mm). Some of them can be discriminated at the Class taxonomic level by electron microscopy or by HPLC pigment analyses, but most of them cannot be identified at lower taxonomic levels. Also, only a small percentage of the picoeukaryotes species grow in culture, and there is no guaranty that organisms currently available in pure culture are dominant in natural communities. <br/>The approximation with molecular techniques offers a promising alternative. The phylogenetic analyses of the rRNA sequences uses techniques such as cloning and sequencing, and/or fingerprinting techniques such as Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) and Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP). With these techniques I have characterized the diversity of eukaryotic picoplankton in natural samples from different marine systems. A wide variety of systems had been sampled from coast to open sea in different oceanographic cruises: Weddel-Scotia Sea (cruise DOVETAIL); Drake Passage (cruise DHARMA); North Atlantic Ocean (cruise ACSOE-NAE); Alborán Sea (cruises MATER´97, 98 y 99). Samples to study spatial and temporal variability of the marine eukaryotic picoplankton were obtained in all these cruises.<br/>Five genetic libraries were generated (two from the Southern Ocean, two from the North Atlantic Ocean and one from the Alborán Sea). By sequencing and comparison with the database I obtained information about the diversity of the phylogenetic groups present in the different marine systems. Results showed a high phylogenetic diversity. Most of these taxonomic groups were affiliated with known phototrophic picoeukaryotes such as prasinophytes (the most frequently represented) and prymnesiophytes. Other clones could be assigned to the heterotropic organisms such as ciliates, some crysophytes, cercomonads and fungi. But a significant number of sequences in the libraries did not show a close affiliation with any know class of organisms and formed two novel lineages: novel stramenopiles and novel alveolates. These novel lineages were abundant and widely distributed. Some of them may account for a large fraction of the heterotrophic microorganisms in the sea and could play an important role in the marine food webs.<br/>Fingerprinting techniques such as DGGE and T-RFLP were used to study de diversity of picoeukaryotes in these same samples. With the optimization of DGGE by using specific primers to amplify the 18S rRNA from eukaryotes we studied diversity and variability of the marine eukaryotic picoplankton assemblages present in samples from the Southern Ocean and the Alborán Sea. With these studies we obtained information about changes in their distribution and composition along the vertical gradient but also at larger spatial and temporal scales.