Actividad formadora de canales transmembrana en la superficie de Gordonia jacobaea

Abstract

Gordonia jacobaea es una bacteria bacilar, no formadora de esporas, catalasa positivo, que producen pigmentos carotenoides de interés industrial, pero que también pertenece al grupo CNM (actinomicetos) donde encontramos géneros de interés clínico como Mycobacterium, Nocardia y Corynebacterium. Estos microorganismos poseen una pared extremadamente hidrofóbica por lo que es de gran interés tanto a nivel industrial como clínico, poder estudiar las proteínas formadoras de canal que en ella se encuentra, ya que con un mejor conocimiento de éstas supone conocer mejor las posibles vías de entra hasta el microorganismo, de sustancias antibióticas.

Hasta el momento se han descrito proteínas formadoras de canal, o porinas, en la mayoría de los géneros de este grupo, pero en el género Gordonia somos los primeros en describir esta actividad. Debido a esta ausencia de publicaciones previa, hemos tenido que adaptar los protocolos existentes y presentados para el estudio otros géneros.

El objetivo de esta tesis ha sido extraer y estudiar la actividad formadora de canales de las proteínas de membrana de Godonia jacobaea, así como secuenciar su genoma con el objetivo de buscar la presencia de secuencias codificantes con alta similitud a secuencias de porinas previamente descritas en el grupo de los micolata.

Para ello se han puesto en práctica distintas técnicas de extracción de proteínas de pared, así como electroforéticas. Las proteínas obtenidas han sido analizadas mediante la técnica de Black Lipid Bilayer, identificándose tres extractos proteicos con actividad formadora de canal. Hemos identificado una primera proteína de pared de 100 kDa aparentes en G. jacobaea, que al ser hervida muestra dos subunidades de 40 y 35 kDa aparentes. Esta proteína forma canales llenos de agua, con una conductancia de 0.8 nS en soluciones de 1M KCl pH7, con selectividad para los aniones y no dependiente de voltaje. En el extracto activo para esta proteína formadora de canales identificamos una proteína de 558 aminoácidos, que muestra una hélice transmembrana entre los aminoácidos 22 y 42, posibles secuencias de hélice alfa más abundantes en la zona amino terminal y láminas beta distribuidas a lo largo de toda la secuencia, pero más abundantes en la región carboxilo terminal. Así mismo también se identificó una región entre los aminoácidos 160 y 276 con similitud a secuencias conservadas de proteínas integrales de membrana (familia CRBC) y una familia de toxinas que forma poros (RTX). Esta proteína no muestra homología con ninguna de las porinas publicadas, ni con otras proteínas con funciones conocidas.

Hemos identificado una segunda proteína de pared de 60 kDa aparentes que forma canales llenos de agua con selectividad por los cationes, una conductancia mayoritaria de 1 nS en 1M KCl, y conductancias minoritarias de 2 y 3 nS, lo que parece indicar una conformación trimérica.

Y hemos identificado una tercera proteína de pared de 20 kDa aparentes que muestra una conductancia de 2 nS en solución de 1M KCl pH7.

Dentro del genoma de G. jacobaea se identifican 4 secuencias codificantes que identificamos como pertenecientes a la familia de porinas MspA. Las secuencias están emparejadas, dos de ellas son de 228 y 229 aminoácidos y las dos restantes de 214 y 239 aminoácidos. Los alineamientos, así como las longitudes de las proteínas parecen indicar que forman parte de la familia MspA. Estas secuencias coinciden con la longitud de la proteína de 20 kDa identificada en este microorganismo como formadora de canales.

The aim of this thesis was to extract and study the proteins with channel-forming activity of Godonia jacobaea,an organism belonging to the micolata group (Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia) and shed some light on the actual role of the porins located in the cell wall with such activity. In order to do so, wall protein extraction techniques and electrophoretic determination methods have been used, as well as Edman sequencing, mass spectrometry, bioinformatics techniques, massive genome sequencing (pyrosequencing), MS/MS, etc.

Proteins obtained from wall extracts were analyzed by the Black Lipid Bilayer technique, allowing us to identify three proteins with pore-forming activity. The first protein, of ~ 100 kDa showed a conductance of 0.8 nS in 1M KCl, selectivity for anions and not voltage-dependent. The second of ~ 60 kDa, displayed a conductance of 1 nS in 1M KCl and selectivity for cations. Finally, the third protein of ~ 20 kDa had a conductance of 2 ns in 1M KCl.

The 100 kDa protein was also studied by mass spectrometry (MS / MS) and Edman sequencing, enabling the identification of its gene, which resulted in a 558 amino acid protein showing a transmembrane region between amino acids 22 and 42, potential alpha helical sequences -more abundant in the amino terminal region- and beta sheets, distributed throughout the entire sequence, being more abundant in the carboxyl terminal region. This protein shows no homology with any of the previously published porins, nor with other proteins of known functions.

At the same time, the whole genome of G. jacobaea has been sequenced, and published in the NCBI database. It was possible to identify four sequences of proteins in the genome of G. jacobaea belonging to the families MspA, a family of channel-forming proteins (porins) belonging to the actinomyces group.