Desarrollo, optimización y evaluación de nuevos métodos inmunológicos y moleculares en el diagnóstico de las infecciones causadas por Legionella pneumophila

Abstract

Legionella se identificó por primera vez en 1976. Es una bacteria ampliamente distribuida en la naturaleza, siendo su nicho natural el medio acuático. Es responsable del 3-15% de las neumonías adquiridas en la comunidad y es, asimismo, causa frecuente de neumonía intrahospitalaria. <br/>En primer lugar, se han evaluado nuevas técnicas de detección de antígeno y al comparar los resultados de la técnica EIA de Bartels con el EIA de Binax, hemos observado que la sensibilidad en muestras de orina no concentrada es mayor con esta nueva técnica sin deterioro de la especificidad. En el caso de la orina concentrada, ambas técnicas muestran una elevada sensibilidad y un 100% de especificidad, ofreciendo por lo tanto una alternativa al EIA Binax cuando se realiza en orina no concentrada. En el caso de la ICT Uni-Gold LUA es también una alternativa en el diagnóstico de la legionelosis, reduciendo el tiempo si lo comparamos con las técnicas de EIA y con unos resultados comparables a la ICT de Binax. Recientemente, se ha podido evaluar una segunda versión de esta nueva ICT (Uni-Gold LUA plus) que ofrece unos valores de sensibilidad y especificidad iguales a la ICT de Binax tanto en orina no concentrada como en orina concentrada. <br/>En segundo lugar se han estandarizado técnicas de concentración. El tiempo necesario para concentrar una muestra de orina, para la posterior detección de antígeno por ultrafiltración pasiva es de 1 a 3 horas, por ese motivo evaluamos una nueva técnica de concentración por centrifugación disminuyendo el tiempo a unos 15-20 minutos. La concordancia global entre las dos técnicas de concentración fue del 100%. Este sistema permite reducir drásticamente el tiempo en el diagnóstico de la legionelosis mediante detección de antígeno.<br/>Al utilizar el EIA de Binax para cuantificar la concentración de antígeno presente en las muestras de orina de pacientes con legionelosis hemos observado que en los pacientes en que se resolvió completamente la neumonía la cantidad de antígeno presente en orina disminuyó significativamente a los 3-6 días respecto a la concentración de antígeno presente en el momento del ingreso (p<0.0001). En cambio en los pacientes con peor evolución y en aquellos que fallecerion la disminución de carga antigénica en orina no fue significativa. Los resultados de este estudio sugieren una correlación entre una mayor concentración de antígeno y una peor evolución de los pacientes. <br/>En esta tesis, también se incluye la evaluación de una técnica inmunológica de detección de antígeno en muestras ambientales para su utilización en el cribaje medioambiental. Se estudiaron muestras de agua artificiales en las que se inoculó Legionella y muestras de agua procedentes de sistemas de agua doméstica y de torres de refrigeración. En nuestro estudio, en las muestras de agua artificial el EIA de Bartels fue capaz de detectar antígeno de todos los serogrupos, aunque mostró una mayor sensibilidad para L. pneumophila serogrupo 1. El límite de detección en agua artificial para el serogrupo 1 fue de 780 ufc/ml en el agua original antes de la filtración. Dado que los brotes de legionelosis suelen ir vinculados a una amplificación de los niveles de Legionella en los sistemas de agua y que durante un brote son necesarias una rápida identificación y descontaminación del sistema de agua colonizado, la detección de antígeno mediante EIA podría ser útil como un método rápido de cribado para analizar un alto número de muestras.<br/>Finalmente, la tesis se completa con la evaluación de técnicas de secuenciación para la identificación a nivel de especie del género Legionella y de tipaje molecular intraespecífico. <br/>El objetivo del estudio fue optimizar la identificación de cepas de Legionella mediante la secuenciación del gen mip. Los resultados obtenidos muestran que la identificación de Legionella spp. mediante la secuenciación de este gen es una técnica sólida, y que la mayoría de los laboratorios son capaces de reproducir y de dar un resultado correcto. <br/>Actualmente, la necesidad de disponer de métodos de caracterización molecular que ofrezcan resultados rápidos y reproducibles, con la posibilidad de ser compartidos en tiempo real por diferentes laboratorios, ha llevado al desarrollo de métodos de secuenciación de genes basados en técnicas de MLST y ha sido empleada para la tipificación molecular de L. pneumophila serogrupo 1. Los resultados obtenidos con el estudio de seis genes, flaA, pilE, asd, mip, mompS y proA, son muy prometedores.

Legionella was first identified in 1976. This bacterium's natural environment is the aquatic means, where it is widely extended. It is responsible for 3 to 15% of in the community-acquired pneumonia cases and a frequent cause of in-hospital developed pneumonia. <br/>Firstly, new antigen detection techniques have been evaluated. A comparison between the results of the Bartels EIA technique and the Binax EIA technique has resulted in the new technique showing a higher sensitivity in non-concentrated urine specimens, without any specificity deterioration. As to what regards concentrated urine specimens, they show a high degree of sensitivity and 100% specificity with both techniques; therefore the Bartels EIA technique may well be a good alternative to the Binax EIA when testing non-concentrated urine specimens. <br/>Regarding the ICT Uni-Gold LUA, has also proven to be a good alternative in diagnosing legionellosis as it shows to be time-saving if compared to the EIA techniques; the results obtained are also comparable to those obtained with the Binax ICT. A second version of this new ICT (Uni-Gold LUA plus) has recently been tested and it shows sensitivity and specificity values equal to those obtained with the Binax ICT in concentrated as well as in non-concentrated urine specimens. <br/>Secondly, concentration techniques have been standardized. The time necessary to concentrate a urine specimen in order to detect the antigen by using passive ultrafiltration is 1 to 3 hours. A new concentration technique using centrifugation reduces this time to 15-20 minutes. There was 100% global match between both concentration techniques. Therefore this technique makes it possible to drastically reduce the time needed to diagnose legionellosis through antigen detection. <br/>The use of Binax EIA in order to quantify the antigen concentration present in urine specimens from patients suffering from legionellosis has shown that in patients whose pneumonia pathology was totally resolved the antigen levels present in their urine were significantly reduced after 3-6 days if compared to the antigen levels measured at the admission (p<0.0001). However, those patients experiencing a worsening of their condition and those who eventually died presented a non-significant lowering of the antigenic levels. The results of this essay suggest a correlation between higher antigen concentration levels and a negative development of the pneumonia pathology.<br/>This study also includes the evaluation of an immunologic technique for detection of antigens in environmental samples in order to use them in environmental sieve. Artificial water samples where Legionella was inoculated were studied, as well as water samples coming from domestic water systems and from refrigeration towers. The Bartels EIA used in the study allowed to detect the antigen of all serogroups although it showed a greater sensitivity towards L. pneumophila, serogroup 1. The detection limit for serogroup 1 in artificial water samples was a level of 780 ufc/ml in the original sample before filtration. Due to the fact that the appearance of legionellosis is usually connected to an increase in the levels of Legionella in the water systems and due to the need to quickly identify and decontaminate the colonized water system, the identification of antigen levels through EIA could be a quick sieving method in order to analyse a high number of samples. <br/>The study is finalized by evaluating sequencing techniques that will allow the identification of the Legionella gender at species level as well as its intraspecific molecular tipification. The objective of this investigation is to optimize the identification of Legionella strains through sequencing the mip gene. The results obtained show that identifying Legionella spp. through sequencing its gene is a solid technique that the majority of laboratories can use and that provides correct scores. At present, the need to have molecular characterization methods that offer quick and easy to reproduce results that can be shared in real time by different laboratories has resulted in the development of gene sequencing methods based on MLST techniques which have been used to carry out a molecular tipification of the L. pneumophila, serogroup 1. The results obtained after studying six genes, flaA, pile, asd, mip, mompS and proA are very encouraging.