The cancer stem cell hypothesis in spontaneous canine gliomas: from tumors to neurogenesis in the adult dog

Abstract

Las células madre cancerosas (CSCs) se pueden originar tanto por la transformación de las células madre normales como a partir de progenitores o células diferenciadas con capacidad de auto-renovación. La hipótesis de las CSCs propone que una subpoblación específica de células es la responsable de mantener el tumor. Esta hipótesis se ha demostrado en una amplia variedad de tumores, incluidos los gliomas. Nestina y CD133 se utilizan como marcadores para la detección de las células madre neurales. En el presente estudio, un total de 20 tumores caninos fueron diagnosticados histopatológicamente como gliomas, de acuerdo con la clasificación internacional de neoplasias del sistema nervioso central en humanos. Posteriormente fueron estudiados mediante inmunohistoquímica (IHC) usando Nestina y CD133 como marcadores de precursores neurales; Neu-N, Doblecortina (DCx) y βIII tubulina como marcadores neuronales; proteína ácida glial fibrilar (GFAP), Vimentina, proteína S-100 y proteína Olig2 como marcadores neurogliales y Ki67 como marcador de proliferación celular. Estos tumores se caracterizaron neuropatologicamente como: oligodendogliomas (grado II), oligodendrogliomas anaplásicos (grado III), glioma mixto (grado II) y glioblastomas (grado IV). La evaluación IHC reveló una positividad mayor de Nestina y CD133 en tumores de alto grado. Olig2 fue expresada en la mayoría de los tumores. La positividad para GFAP fue mayor en el glioma mixto y los glioblastomas. Los marcadores de neurona diferenciada fueron negativos, mientras que en algunos gliomas de alto grado se detectó positividad para DCX. Nuestros resultados están de acuerdo con la hipótesis de las CSCs, confirmando la presencia de precursores neurales en los gliomas caninos sobretodo en los de grado más alto. Posteriormente, el estudio in vitro de células extraídas de áreas del centro y periferia de gliomas caninos permitieron evaluar la capacidad de proliferación, expansión y superviviencia de los progenitores neurales en estos tumores. Se obtuvieron neuroesferas de todas las muestras correspondientes al centro del tumor indicando la existencia de precursores neurales en tumores de todos los grados de glioma canino. Además, la cantidad de células capaces de proliferar se vio incrementada en los tumores de mayor grado, indicando la posible influencia de estos precursores neurales en su comportamiento maligno. Los precursores neurales aislados de todas las muestras con capacidad de expansión fueron capaces de diferenciar en las tres líneas neurales indicando su multipotencialidad. Estos resultados demostraron la participación de progenitores neurales en los gliomas caninos, de acuerdo con el segundo criterio de demostración de la hipótesis de las CSCs. En paralelo se estudiaron las células madre neurales en fases post-natales del cerebro de perro adulto. Para ello se estudió la citoarquitectura de su principal nicho, la zona subventricular (SVZ) anterior la cual ha sido ampliamente descrita en humanos y especies murinas. Mediante el estudio histológico, immunohistoquímico, ultraestructural y cultivo celular, se confirmo la presencia de células neurales multipotentes en nichos neurogénicos estructural y celularmente similares a los descritos en otras especies. Además, la arquitectura de estos componentes es similar a la descrita en humanos, probablemente relacionado con una complejidad similar de las estructuras encefálicas. Por último, se identificaron cadenas de neuroblastos migradores asociados a estructuras vasculares fuera de la SVZ indicando la elevada capacidad de migración y adaptabilidad de las células madre neurales residentes en el encéfalo y comparable con eventos similares descritos en otras especies de mamíferos incluyendo la especie humana. Los resultados de los estudios llevados a cabo en esta tesis doctoral concluyen que el perro puede ser un modelo animal relevante en futuros estudios relacionados con la identificación de nuevas dianas terapéuticas en el campo de la oncología, así como un modelo a considerar en estudios relacionados con la neurogénesis en el individuo adulto.

Cancer stem cells (CSCs) can originate both from the transformation of normal stem cells as progenitors or from more differentiated cells that have acquired capacity for self-renewal. The hypothesis of the CSCs proposes that a specific subpopulation of cancer stem cells is responsible for maintaining the tumor. This hypothesis has been demonstrated in a wide variety of tumors, including gliomas. Nestin and CD133 are used as markers for the detection and study of neural stem cells. In the present study, a total of 20 canine brain tumors were diagnosed as glioma, according to the international classification of tumors of the central nervous system in humans. They were studied by immunohistochemistry (IHC) using Nestin and CD133 as markers of neural precursors; Neu-N, doublecortin (DCx) and βIII tubulin as neuronal markers; glial fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, S-100 protein and protein Olig2 as glial markers and Ki67 as a marker for cell proliferation. These tumors were neuropathologically classified as: oligodendogliomas (Grade II), anaplastic oligodendrogliomas (Grade III), mixed glioma (grade II) and glioblastomas (grade IV). IHC evaluation showed higher positivity for Nestin and CD133 in high-grade gliomas (HGG). Olig2 was expressed in most tumors, whereas positivity for GFAP was higher in the mixed glioma and glioblastomas. Differentiated neuron markers were negative, while in some HGGs DCX positivity was detected. Our results are in agreement with the CSCs hypothesis, confirming the presence of undifferentiated neural precursors in canine gliomas. Subsequently, tissue grafts extracted from areas of the center and periphery of canine gliomas were cultured in vitro by neurosphere assay in order to assess the ability of proliferation, expansion and survival of the neural progenitors. Neurospheres of all samples corresponding to the center of the tumor were obtained indicating the existence of neural precursors in tumors of all grades of canine glioma. Furthermore, the amount of cells capable of proliferating was increased in HGGs, indicating the possible influence of these neural precursors in their malignant behavior. The neural precursors isolated from all samples were able to differentiate into three neural lines indicating their multipotentiality. These results demonstrated the involvement of neural progenitors in canine gliomas, according to the second criteria for demonstration of the hypothesis of CSCs. In parallel neural stem cells from normal postnatal adult dog brain phases were studied. The cytoarchytecture of its main niche it was studied in the adult brain. This corresponds to the subventricular zone (SVZ) which has been widely described in human and murine species. By histological, immunohistochemical, ultrastructural and cell culture studies, the presence of multipotent neural cells in SVZ was confirmed, residing in neurogenic niches and structurally and cellularlly similar to those described in other mammalian species. Moreover, the architecture of these components was similar to that described in humans, probably related with complexity similar brain structures, which could be related to adult neurogenesis related processes. Finally, chains of migratory neuroblasts associated with vascular structures outside the SVZ indicated a high migration capability and adaptability of resident neural stem cells in the brain of adult and comparable with similar events described in other mammalian species including humans. The results of the studies performed in this thesis conclude that the dog can be a relevant animal model in future related to the identification of new therapeutic targets in the field of comparative oncology studies, as well as a model to consider in studies and the progress of studies related to neurogenesis in the adult individual.