Novel molecular tools to study mycoplama cells

Abstract

Els micoplasmes són patògens humans que es caracteritzen per la seva reduïda mida i per ser els organismes de vida lliure coneguts amb els genomes més petits. Tot i la seva aparent simplicitat a nivell genòmic presenten una complexitat molt més elevada que requereix de les tècniques moleculars més avançades per tal de ser estudiada i entesa en la seva totalitat. Però les eines disponibles actualment per a la modificació de les cèl·lules de micoplasma es redueix a un petit repertori basat en minitransposons, plasmidis replicatius per algunes espècies i la recombinació homòloga intrínseca en algunes espècies i soques específiques. És per això que en aquesta tesi s’han desenvolupat i implementat tècniques que permetin la modificació d’aquestes cèl·lules ampliant el ventall i posant a disposició noves eines que permetin anàlisis que fins ara quedaven limitats a altres bactèries. En aquest treball s’aporten coneixements nous sobre les localitzacions de diferents proteïnes integrants de l’organel·la terminal de Mycoplasma genitalium, una estructura clau en la motilitat i la patogenicitat d’aquest microorganisme. A més es demostra l’utilitat de les proteïnes fluorescents com a marcadors i eines moleculars per a l’estudi de M. genitalium. D’altra banda, s’ha implementat el sistema Cre-lox a M. genitalium permetent així fer delecions al genoma sense deixar més marques que 34 bp de les seqüències lox i permetent l’eliminació dels marcadors de resistència a antibiòtics. Finalment, també s’ha implementat el sistema d’interferència de iCRISPR a Mycoplasma pneumoniae, permetent així per primer cop la downregulació de gens de forma específica. A més a més, la implementació d’aquesta tècnica obre les portes a l’estudi de gens essencials que fins ara no era possible en aquest microorganisme.

Mycoplasmas are human pathogens characterized by their reduced size and for being the free-living organisms with the smallest genomes known. Despite their apparent genomic simplicity, they present a much higher complexity that requires the most advanced molecular techniques to be studied and understood in their entirety. But the tools currently available for the modification of mycoplasma cells are reduced to a small repertoire based on minitransposons, replicative plasmids for some species and intrinsic homologous recombination in some species and specific strains. For that reason, this thesis has developed and implemented techniques that allow the modification of these cells, making available new tools that allow analysis that were limited to other bacteria until now. New knowledge on the locations of different proteins belonging to the Mycoplasma genitalium terminal organelle, a key structure in the motility and pathogenicity of this microorganism, is provided in this work. In addition, this work reinforces the usefulness of fluorescence proteins as molecular markers for the study of M. genitalium. On the other hand, the Cre-lox system has been implemented in M. genitalium , allowing deletions without leaving more marks than 34 bp of the lox sequences. Moreover, this technology also allows the elimination of antibiotics resistance gene markers. Finally, iCRISPR interference system has been implemented in Mycoplasma pneumoniae, allowing for the first time the downregulation of genes in a specific way. In addition, the implementation of this technique opens the doors to the study of essential genes that until now was not possible in this microorganism.