Ciclina E2, nova diana del checkpoint de fase S. Paper en la modulació de la resposta a inhibidors de la topoisomerasa I

Abstract

El checkpoint de la fase S constitueix una barrera anti-càncer. Quan aquest mecanisme de vigilància detecta situacions que posen en perill la integritat genòmica, tals com dany al DNA o estrès replicatiu, genera una resposta que engloba la protecció de la replicació, l'aturada del cicle cel·lular i l'activació i coordinació dels sistemes de reparació del DNA. En última instància, si la crisi no es superada el checkpoint promou l'entrada en apoptosis via p53. Per aquest motiu, la mutació d'elements d'aquest mecanisme de control ha estat àmpliament implicada en tumors primaris humans, ja que afavoreixen l'aparició d'inestabilitat genòmica, un dels motors de la transformació cel·lular maligna. A pesar de la importància d'aquest mecanisme de vigilància en el seu paper antitumoral, la gran majoria de les seves dianes romanen desconegudes. Per tal d'identificar noves seqüències implicades en la resposta, es van realitzar 2 aproximacions a gran escala, obtenció de proteomes 2D-DIGE checkpoint dependents utilitzant com a model S. cerevisiae i l'obtenció de microxips d'expressió en resposta a estrès replicatiu en cèl·lules HeLa. Finalment, van permetre identificar la ciclina E2 com a nova diana del checkpoint de fase S. La ciclina E2 és imprescindible perquè les cèl·lules pugin superar la transició G1/S, comprometent-se a una ronda de cicle cel·lular. En resposta a estrés genotòxic és acumulada de forma dependent de l'activació del checkpoint de la fase S. Aquesta estabilització implica alts nivells del seu mRNA i requereix síntesi de novo continuada. Els nostres resultats indiquen que l'acumulació de ciclina E2 podria actuar alentint la progressió de la fase S, evitant d'aquesta manera que cromosomes danyats siguin segregats en mitosis aberrants. Per altra banda, la ciclina E2 es troba sobreexpressada en un elevat número de tumors primaris. Donada la seva implicació en la resposta del checkpoint, vam avaluar si presenta modulació a la resposta a agents quimioteràpics que afecten l'estructura del DNA. Els assaigs de viabilitat in vitro enfront a inhibidors de la topoisomerasa I, mostren que la ciclina E2 confereix resistència enfront la teràpia. Per tant, de confirmar-se aquests resultats in situ, podria ser utilitzada com a biomarcador de resposta.

The S-phase checkpoint acts as an anti-cancer barrier. When the surveillance mechanism detects dangerous situations for the genome integrity such as DNA damage or replication stress, the S-phase checkpoint generates its own response, including replication protection, cell cycle arrest and activation and coordination of DNA repair systems. Finally, if stress situation is not by-passed, the S-phase checkpoint induces cell death through apoptosis via p53. For these reasons, mutations in the mechanism elements are widely related with tumorogenesis processes, because they arise the emergence of genome instability, a driving force of malignant cell transformation. Despite the importance of this mechanism in its anti-cancer role, most of its targets are still unknown. To identify new sequences involved in the response, we used two high-throughput approaches: checkpoint-dependent 2D-DIGE proteomes in S. cerevisiae under replication stress conditions and expression microarrays in replication stress conditions using human HeLa cells. Finally we identified cyclin E2 as a novel S-phase checkpoint target. Cyclin E2 is essential to cells to by-pass G1/S boundary, entering in cell cycle. Cyclin E2 levels are stabilized in a S-phase checkpoint dependent manner. This stabilization involves the cyclin E2 mRNA increase and the continuous de novo synthesis of the protein. Our results indicate that cyclin E2 accumulation could delay the S-phase progression, avoiding the segregation of partially replicated chromosomes in aberrant mitosis. On the other hand, as cyclin E2 has been found over-expressed in a high number of human primary tumours, we next tested if the over-expression of cyclin E2 could modulate the response to DNA-based chemotherapy agents. Viability in vitro assays confirmed that cyclin E2 confers resistance to toisomerase I inhibitors. This result postulates cyclin E2 tumour levels as a prediction biomarker for chemotherapy response.