Producción de la lipasa LIP2 de Candida rugosa en el sistema Pichia pastoris: caracterización y aplicación en reacciones de síntesis

Abstract

Las lipasas son enzima con numerosas aplicaciones en biocatálisis debido a su reacción natural, hidrólisis de enlaces éster, como a su utilización en reacciones de transesterificación y síntesis orgánica. Se destaca como productor de lipasas la levadura Candida rugosa. Existen lipasas comerciales de este microorganismo, pero tienen el inconveniente de ser una mezcla de isoenzimas que hace inviable el proceso de purificación. La alternativa es la producción heteróloga de la lipasa 2 en otro microorganismo. No obstante, esta vía topa con la peculiaridad de que C. rugosa no sigue el código genético universal para el amino ácido serina. <br/>Con objeto de obtener el gen sintético, se diseñó y optimizó la secuencia nucleotídica de rLip2 para su expresión en Pichia pastoris, su inserción en el vector de expresión pPICZ&#945; bajo el control transcripcional del promotor de la alcohol oxidasa, su transformación en P. pastoris y la selección de clones productores de rLip2 activa. <br/>Comprobada la obtención de clones productores de rLip2 funcional, se determinó el pH óptimo de producción mediante estrategias de operación en discontinuo, paso previo a la optimización de la operación en discontinuo alimentado. <br/>Al trabajar con fermentaciones en discontinuo alimentado no se detectó presencia de actividad lipásica. Análisis por Western blot revelaron que estábamos en presencia se de agregados de rLip2, que no tenían actividad lipásica. <br/>La hipótesis que se planteó para justificar la formación de los agregados de rLip2 fue la elevada salinidad del medio de cultivo. Mediante la disminución de la fuerza iónica del medio mediante ultra y diafiltración se recupero la actividad enzimática, detectando el monómero de rLip2. La producción del producto heterólogo fue 10 veces superior a del microorganismo natural. <br/>Se realizó una caracterización bioquímica y funcional determinándose el óptimo de temperatura y pH, su especificidad frente a p-nitrofenoles y triglicéridos. El estudio de estabilidad demostró que la enzima recombinante en solución era menos estable que la nativa. No obstante, al inmovilizar la rLip2 se consiguió obtener una isoenzima más estable con el valor añadido de poder ser reutilizada. <br/>Finalmente, se realizaron aplicaciones biocatáliticas de rLip2 en reacciones de síntesis enantioméricas para la resolución de mezclas rácemicas de compuestos de interés farmacéutico. Si bien para la resolución racémica del trans-2-fenil-1-ciclohexanol, la rLip2 no fue tan efectiva como la isoenzima nativa, para la resolución del ibuprofeno, se obtuvieron mejores resultados en términos de conversión, exceso y factor enantiomérico que con la nativa.

Lipases are enzymes with a wide range of applications in biocatalysis due to its natural reaction, hydrolysis of ester bounds, as well as to their use in transesterification and synthesis reactions. The yeast Candida rugosa is a well known lipase producer; there are several C. rugosa lipase preparations commercially available, but they have the inconvenience of being a mixture of several lipase isoenzymes with similar physicochemical properties, i.e. hampering the efficiency of their separation process. <br/>Thus, the recombinant production of C. rugosa lipases, particularly of the lipase 2 isoenzyme (Lip2), in another host microorganism is an attractive alternative. However, this strategy is hampered by the fact that C. rugosa may use a non-universal codon for Serine. We designed and synthesised a codon-optimised lip2 gene for its expression in Pichia pastoris. The synthetic gene was inserted into the pPICZ&#945; expression vector under the transcriptional control of the alcohol oxidase promoter, and cloned into P. pastoris. Transformants were selected in small scale cultivations for active rLip2 expression. In the following step, we determined the optimum pH for lipase production in preliminary bioreactor batch cultivations. However, when the producing strain was tested in fed-batch bioreactor cultivations, no lipolytic activity was detected in culture supernatants. Nevertheless, Western Blot analyses revealed that rLip2 was being produced as aggregates, with no apparent lipolytic activity. This observation suggested that the formation of rLip2 aggregates was related to the high ionic strength of the culture medium. Thus, cleared culture supernatants were subjected to ultra/diafiltration. By reducing the ionic strength of the cleared supernatant, the enzymatic activity could be recovered, also detecting the monomeric rLip2 form. Notably, the recovered lipase activity was 10-fold higher to that recovered from a cultivation process at the same scale with the native enzyme producer. The recombinant enzyme was biochemically and functionally characterized. In particular, we determined its optimum temperature and pH for activity, as well as its specificity towards p-nitrophenols and tryglycerides. Also, the stability study revealed that the recombinant enzyme is less stable than the native enzyme preparation. Nevertheless, when the rLip2 was immobilized on a solid support, stability was substantially improved, having the possibility of reuse as an additional advantage. Finally, the potential of rLip2 as a biocatalyst was tested in two different reactions of enantiomeric synthesis, for the resolution of racemic mixtures of compounds of pharmaceutical interest. Although rLip2 resulted to be less efficient than the native lipase preparation for the racemic resolution of trans-2-phenyl-1-ciclohexanol, the recombinant enzyme showed an improved performance (in terms of conversion, enantiomeric excess and enantiomeric factor) in relation to the native enzyme preparation for the resolution of ibuprofen.