Intestinal anastomosis wound healing after platelet-rich plasma (PRP) application on pigs. Macroscopic, microscopic and breaking strength evaluations

Abstract

La enterectomía es un procedimiento quirúrgico que consiste en suturar dos segmentos intestinales, la mayor complicación que aparece es la pérdida por las suturas y las dehiscencias y que están asociadas a una alta morbilidad y mortalidad. En pequeños animales las complicaciones en las anastomosis del intestino delgado tienen una incidencia 7-16%, y cerca 74-80% de estos pacientes mueren. Se han realizado diversos procedimientos para asegurar la impermeabilidad de la anastomoses: Omentoplastia, parches de serosa, endotubos, anillos ajustables internos y entre otros. También se han buscado nuevas innovadoras alternativas quirúrgicas, que incluyeron el uso de sustancias adhesivas, fibrinas elaboradas por moléculas (fibrinógeno y trombina). <br/>Desde hace varios años, los estudios relacionados con la regeneración se han dirigido a investigar cuál es el efecto de los factores de crecimiento sobre los tejidos. Gran parte de los estudios se han realizado in vitro, utilizando factores recombinantes, es decir, factores de crecimiento elaborados en el laboratorio. Pero la desventaja de estas sustancias incluye el alto coste económico para su obtención. Y poco se sabe de sus efectos secundarios.<br/>Actualmente, el estudio del proceso de la cicatrización se centra en la aceleración de este proceso a nivel celular con el uso de plasma rico en plaquetas (PRP). En el presente estudio se han incluido 35 cerdos de raza Large White, sexo indiferente con un peso medio de 55±5 Kg. En cada animal, se realizaron 2 enterectomías, en una de ellas se le aplicó PRP en el lugar de la incisión, mientras que en la otra no, sirviéndonos como control. Para el examen histológico se realizaron 5 grupos de 3 animales cada uno. Los cerdos se eutanasiaron a las 24h, 48h, 72h, 96h y 7 días, respectivamente, tras la cirugía. Para la evaluación de la resistencia de la anastomosis, se emplearon 2 grupos de 10 animales cada uno. El grupo A se eutanasió a los 3 días tras la cirugía, mientras que el grupo B se eutanasió a los 7 días. A nivel histológico en todas las muestras de las 24h y 48h, tanto en las muestras control como PRP, mostraron una creciente inflamación que finalmente, a las 72h y 96h fue substituida por un tejido de granulación inmaduro. La presencia de tejido de granulación fue más abundante en las muestras PRP. <br/>En la determinación de la fuerza de rotura no se obtuvieron diferencias significativas en la resistencia de la anastomosis entre el grupo control y el PRP, para ninguno de los 2 días (3 y 7 días). Sin embargo, aunque los resultados no sean significativos, las mayores fuerzas de rotura obtenidas corresponden a las anastomosis con PRP.<br/>Para la determinación de la activación plaquetar evaluamos los valores del componente plaquetar medio (MPC) en la sangre y PRP obtenidos durante el recuento (ADVIA 120). Los valores del MPC obtenidos en la sangre (21,3±1,58 g/dL) y en el PRP (20,3±1,39 g/dL), no mostraron diferencias significativas. Este hecho sugiere que el protocolo de preparación de PRP no produce una activación significativa de las plaquetas. <br/>Para la determinación de factores de crecimiento usamos el test (ELISA). Los niveles del TGF- &#946;1 han sido determinados en distintas fracciones que se obtenien durante la preparación del PRP: en el PRP (24312 pg/mL) y PRP gel, activado con cloruro cálcico (15504 pg/mL) y en el plasma pobre en plaquetas (PPP) - obtenido después de la segunda centrifugación (3715 pg/mL). En resumen con el protocolo de obtención de PRP utilizado en este estudio se obtuvo una elevada concentración e integridad plaquetar demostrado en los valores del MPC y los niveles de TGF-&#946;1. <br/>Palabras clave: anastomosis intestinal, cerdo, plaquetas, plasma rico en plaquetas, factores de crecimiento.

The principle of performing an intestinal anastomosis consists of apposing the proximal and distal edges of the segments and suturing. Compromised healing may lead to dehiscence and leakage, which is attended by high morbidity and mortality. In small animals the reported incidence of small intestinal dehiscence rates 7-16%, with 74 -80% of those patients dying. Attempts to enhance anastomotic healing have included the use of various surgical techniques and materials: quality of suture threads, use of staples; mechanical protection (endoluminal latex prosthesis, biofragmental ring) and local application of fibrin bioadhesive, fibrin and collagen patches, omental flaps with the most promising results.<br/>One of the most significant advances in the field of modern molecular biology and biochemistry in the last three decades are certainly growth factors and cytokines. Growth factors are biologically active polypeptides influencing growth, differentiation and metabolism of target cells through specific receptors. In the last several years a number of authors investigated the use of various recombinant growth factors (local or systemic) in order to enhance some of the phases of wound healing process.<br/>The disadvantage of these recombinant growth factors is that they are expensive and concerns exist about their safety in human administration. Alternatively, platelet-rich plasma (PRP), which is a volume of autogenous plasma that has a platelet concentration above baseline, is a proven source of growth factors. <br/>Recently, attention has been focused on cellular acceleration of the wound healing process by the use of platelet-rich plasma (PRP). This study determined the effects of PRP application on intestinal healing. Autologous PRP was obtained in 35 Large White breed pigs, males and females, weighting 55±5 Kg, which were submitted to two intestinal anastomosis procedures. <br/>Activated PRP was applied in one of the anastomosis sites, while the other site served as control. After 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 7 days, histology was performed, and after 72 h and 7 days breaking strength was also measured. After 24-48 h of PRP and control anastomosis, increasing inflammation was observed, followed by immature granulation tissue at 72-96 h. In PRP samples, the granulation tissue was more abundant. Although breaking strength in PRP samples was higher than in control samples, differences were not statistically significant. Although differences were subtle, PRP application on intestinal anastomosis seemed to slightly improve the anastomotic resistance due to an increase of inflammatory infiltrates and fibrosis.<br/>In this study we also determinate the platelet activation using a mean platelet component (MPC), we monitored MPC values on citrated whole blood and on PRP in all (47) animals used in this study obtained on (ADVIA 120) (a decrease in the MPC value occurs when platelets are activated and degranulated in vitro). The MPC values were not statistically significantly different (p<0.05) on citrated whole blood (21,3±1,58 g/dL) when compared to PRP (20,3±1,39 g/dL) values. In our opinion, this finding might be the result of the non significant platelets activation during PRP preparation process.<br/>We analyzed the amount of TGF-&#946;1 by enzyme-linked immunosorbent sandwich assay (ELISA) on PRP (obtained after double spin centrifugation), PPP (supernatant after second centrifugation) and PRP gel (obtained by mixing fresh PRP and calcium chloride). In our study, concentrations of TGF-&#946;1 on PRP fractions were different. The concentration of TGF-&#946;1 on PRP (24312 pg/mL) was significantly increased compared to PPP (3715 pg/mL). This supposes that the protocol for PRP obtention using a double spin centrifugation procedure employed in this study results in a high platelet concentrate and maintains a high quality biological product as measured by MPC values and TGF-&#946;1 levels.<br/>Keywords: intestinal anastomosis, pig, platelets, platelet-rich plasma, growth factors.