Development and application of localization-based microscopy methods to study the structure and dynamics of chromatin through the process of cellular differentiation

Abstract

Recent advancements in single-molecule localization-based microscopy have made it possible to visualize biological structures and dynamic processes within the cell with unprecedented spatial resolution. Determining the spatial organization of these complex structures, like chromatin, under physiological and pathological conditions is an important biological goal. Currently, one of the main limitations of this family of techniques is the difficulty to extend them to multiple colors, so that multiple target molecules can be imaged simultaneously. We developed an approach for simultaneous multi-color super resolution imaging which relies solely on fluorophore excitation, rather than fluorescence emission properties. By modulating the intensity of the excitation lasers at different frequencies, we show that the color channel can be determined based on the fluorophore’s response to the modulated excitation. We use this frequency multiplexing to reduce the image acquisition time of multi-color super resolution DNA points accumulation in nanoscale topography (DNA-PAINT) while maintaining all its advantages: minimal color cross-talk, minimal photobleaching, maximal signal throughput, ability to maintain the fluorophore density per imaged color, and ability to use the full camera field of view. One outstanding biological question that will benefit from the development and application of advanced imaging technologies is the relationship between chromatin structure and gene activity. Chromatin is a complex of DNA and histone proteins, which helps compact and spatially organize the genetic code within the small space of the nucleus. Applying super resolution microscopy, previous work in the lab showed that nucleosomes within folded chromatin fibers are organized in heterogeneous groups named nucleosome clutches, unlike the textbook model that suggested a much more ordered and hierarchical folding of nucleosomes. Nucleosome clutches are smaller and less densely compacted in embryonic stem cells (ESCs) compared to neuronal progenitor cells (NPCs), in correlation with the more open chromatin state of ESCs. We applied modelling of chromatin and Single Molecule Tracking (SMT) to compare the structure of synthetic fibers and local nucleosome dynamics with the super resolution images of chromatin fiber in ESCs and NPCs. First, using coarse-grained modeling, we simulated the spatial arrangement of chromatin fibers corresponding to the pluripotency gene Oct4 in mouse ESCs (mESCs) and mouse NPCs (mNPCs), taking into account nucleosome positions from MNASE-Seq data, the ratio of linker histone H1 per nucleosome, and the amount of histone tail acetylation. The resulting folded fiber configurations showed higher compaction of the overall fiber and of the nucleosome clutches in mNPCs compared to mESCs, recapitulating the super resolution imaging data. We further use SMT both at short (15ms) and long (500ms) exposure times to show that nucleosome turn over and local dynamics within the chromatin fiber correlate with the structural features observed in super-resolution data and the polymer models.

Los avances recientes en el campo de la microscopía basada en la localización de moléculas únicas ("localization-based microscopy") han permitido visualizar estructuras biológicas y procesos dinámicos dentro de la célula con una resolución espacial sin precedentes. Determinar la organización de estructuras complejas, como la cromatina, bajo condiciones fisiológicas y patológicas es uno de los objetivos más importantes del campo de la biología molecular. En la actualidad, una de las principales limitaciones de esta familia de técnicas experimentales es la dificultad de extenderlas a múltiples colores, de manera que se puedan visualizar simultáneamente múltiples moléculas de interés. En la primera parte de mi doctorado, hemos desarrolado un método que permite la adquisión simultánea de imágenes de microscopía multi-color de súper resolución, basado únicamente en la excitación de fluoróforos, en lugar de en sus propiedades de emisión de fluorescencia. A través de la modulación de la intensidad de los láseres de excitación a diferentes frecuencias, los distintos canales pueden ser identificados en base a la respuesta del fluoróforo. Este método permite reducir el tiempo de adquisición de las imágenes con la técnica "DNA points accumulation in nanoscale topography" (DNA-PAINT), al tiempo que mantiene todas sus ventajas: mínima interferencia entre los distintos canales, mínimo fotoblanqueamiento de los fluoróforos, máximo intensidad de la señal de fluorescencia, capacidad de mantener la densidad de fluoróforos por canal de la imagen y capacidad de utilizar el campo de visión completo de la cámara. Una cuestión biológica pendiente que se beneficiará del desarrollo y aplicación de estas técnicas avanzadas de microscopia es la relación entre la estructura de la cromatina y la actividad genética de una célula. La cromatina es un complejo compuesto por ADN, proteínas e histonas, que ayuda a compactar y organizar el genoma dentro del reducido espacio del núcleo celular. Aplicando microscopía de súper resolución, trabajos previos han demostrado que, dentro de las fibras plegadas de cromatina, los nucleosomas están organizados en grupos heterogéneos llamados "nucleosome clutches". Esto difiere del modelo que aparece en los libros de texto, el cual sugería un plegamiento de los nucleosomas mucho más ordenado y jerárquico. Además, estas observaciones mostraron que los grupos de nucleosomas son más pequeños y menos densos en las células madre embrionarias (ESC) en comparación con las células progenitoras neuronales (NPC), en correlación con el estado de compactación de la cromatina. En este proyecto hemos utilizado modelos computacionales y el método de microscopía avanzada llamado "Single Molecule Tracking" (SMT) para comparar la estructura de fibras sintéticas de cromatina y la dinámica de los nucleosomas, con las imágenes de súper resolución de la fibra de cromatina en el proceso de diferenciacón celular (desde ESCs hasta NPCs). En primer lugar, utilizando un modelo de grano grueso ("coarse-grained model"), hemos generado estructuras de las fibras de cromatina correspondientes a una región de 30kpb alrededor del gen de pluripotencia Oct4. Para ello hemos obtenido las posiciones de los nucleosomas a partir de los datos de MNase-Seq, y la proporción de la histona H1 por nucleosoma y la cantidad de acetilación de la cola de la histonas, a partir de datos experimentales. Las configuraciones de las fibras plegadas resultantes mostraron una mayor compactación total y de los grupos de nucleosomas en las células NPC, en comparación con las ESC, recapitulando los datos de obtenidos de las imágenes de súper resolución. Además, los datos de SMT, tanto en tiempos de exposición de cámara cortos (15ms) como largos (500ms), muestran que la reposición de los nucleosomas en la cromatina y la dinámica local dentro de la fibra se correlacionan con las con las características estructurales observadas en los datos de superresolución y los modelos de polímeros.