Human prion-like proteins and their relevance in disease

Abstract

Les “prion-like proteins” han anat adquirint una atenció cada cop major en els últims anys. El seu interès recau en: i) la seva implicació en malalties degeneratives; ii) la quantitat d’elles que presenten mutacions genètiques que augmenten el risc a patir la malaltia; iii) la seva habilitat d’establir interaccions proteiques; i iv) la seva participació en la formació dels orgànuls sense membrana. Els prions de llevat són proteïnes amb la capacitat de canviar d’un estat soluble a un amiloide com a sistema adaptatiu per fer front a canvis ambientals. La majoria dels prions de llevat tenen un “prion forming domain” (PFD) desordenat i de baixa complexitat, enriquit en Gln i Asn, i empobrit en residus hidrofòbics o amb càrrega. Per tal de descobrir nous prions de llevat, es van desenvolupar eines computacionals que després es van usar per buscar proteïnes amb dominis similars als PFDs de llevat en altres proteomes, incloent l’humà. Aquestes proteïnes es van anomenar “prion-like”, i les seves regions identificades “prion-like domains” (PrLDs). Els PrLDs tenen una composició similar als PFDs de llevat, i comparteixen la capacitat d’agregar, replicar-se i propagar-se. En moltes malalties degeneratives s’han trobat dipòsits citoplasmàtics compostos de “prion-like proteins”, de les quals s’han descrit mutacions genètiques en el seu PrLD. La gran majoria de “prion-like proteins” són nuclears, però es transloquen al citoplasma quan provoquen la malaltia. Aquest fenomen s’ha associat a la seva agregació en forma amiloide. En aquesta tesis hem identificat nous candidats “prion-like” potencials, i hem validat experimentalment per set d’ells la regió responsable de la seva agregació. També hem millorat les prediccions de l’impacte de les mutacions genètiques en el procés d’agregació de les “prion-like proteins”. S’ha vist que les “prion-like proteins” tenen la capacitat de formar orgànuls sense membrana dinàmics i reversibles en funció de les condicions cel·lulars, com per exemple en situacions d’estrès. Quan aquests canvis cel·lulars són massa persistents, aleshores els orgànuls sense membrana deixen de ser reversibles donant lloc als dipòsits sòlids trobats en pacients. Encara estem lluny de conèixer el mecanisme exacte de la formació dels orgànuls sense membrana. Per aquesta raó, en aquesta tesis hem estudiat la “prion-like protein” hnRNPDL humana a fons per intentar expandir el coneixement sobre aquests fenòmens i la seva connexió amb la malaltia. Hem caracteritzat les propietats d’autoassemblatge de les isoformes de hnRNPDL demostrant la importància del splicing alternatiu en controlar els esdeveniments de separació de fase, i ensenyem que les mutacions D378N/H involucrades en malaltia acceleren dramàticament l’agregació de hnRNPDL, reduint la seva solubilitat en el múscul de Drosophila. Les “prion-like proteins” són nuclis de grans xarxes d’interaccions proteiques a través del seu PrLD. S’ha vist que un nombre significatiu de PFDs de llevat tenen regions “coiled-coil” que participen en el seu procés d’agregació. En aquesta tesis demostrem que això també passa pels PrLDs humans i hem caracteritzat la proteïna MED15 com a exemple, mostrant que el seu PrLD forma fibres amiloides en un procés mediat pel seu “coiled-coil”, fet que pot explicar el seu rol en malaltia. En general, aquesta tesis és un estudi exhaustiu de les “prion-like proteins” i les seves propietats.

Las “prion-like proteins” han ido adquiriendo una atención cada vez mayor en los últimos años. Su interés se debe a: i) su implicación en enfermedades degenerativas; ii) la cantidad de ella que presentan mutaciones genéticas que aumentan el riesgo de sufrir la enfermedad; iii) su habilidad en establecer interacciones proteicas; iv) su participación en la formación de orgánulos sin membrana. Los priones de levadura son proteínas con la capacidad de cambiar de un estado soluble a uno amiloide como sistema adaptativo para hacer frente a cambios ambientales. La mayoría de priones de levadura tienen un “prion forming domain” (PFD) desordenado y de baja complejidad, enriquecido en Gln y Asn, y empobrecido de residuos hidrofóbicos o con carga. Con el fin de descubrir nuevos priones de levadura, se desarrollaron herramientas computacionales que se usaron después para buscar proteínas con dominios similares a los PDFs de levadura en otros proteomas, incluido el humano. Estas proteínas se llamaron “prion-like”, i sus regiones identificadas “prion-like domains” (PrLDs). Los PrLDs tienen una composición similar a los PFDs de levadura, i comparten su capacidad de agregar, replicar y propagarse. En muchas enfermedades degenerativas se han encontrado depósitos citoplasmáticos compuestos por las “prion-like proteins”, de las cuales se han descrito mutaciones genéticas en su PrLD. La gran mayoría de “prion-like proteins” son nucleares, pero se translocan al citoplasma cuando provocan la enfermedad. Este fenómeno se ha asociado a su agregación en forma amiloide. Por tanto, en esta tesis hemos identificado nuevos candidatos “prion-like” potenciales y hemos validado experimentalmente para siete de ellos la región responsable de su agregación. También hemos mejorado las predicciones sobre el impacto de las mutaciones genéticas en el proceso de agregación de las “prion-like proteins”. Se ha vista que las “prion-like proteins” tienen la capacidad de formar orgánulos sin membrana dinámicos y reversibles en función de las condiciones celulares, como por ejemplo en situaciones de estrés. Cuando estos cambios celulares son demasiado persistentes, entonces los orgánulos sin membrana dejan de ser reversibles dando lugar a los depósitos sólidos encontrados en los pacientes. Aún estamos lejos de conocer el mecanismo exacto de la formación de los orgánulos sin membrana. Por este motivo, en esta tesis hemos estudiado la “prion-like protein” humana hnRNPDL a fondo para intentar expandir el conocimiento sobre estos fenómenos y su conexión con la enfermedad. Hemos caracterizado las propiedades de auto-ensamblaje de las isoformas hnRNPDL demostrando la importancia del splicing alternativo en controlar los sucesos de separación de fase, y enseñamos que las mutaciones D378N/H involucradas en enfermedad aceleran dramáticamente la agregación de hnRNPDL reduciendo su solubilidad en el músculo de Drosophila. Las “prion-like proteins” son nucleos de grandes redes de interacciones proteicas a través de su PrLD. Se ha visto que un número significativo de PFDs de levadura tienen regiones “coiled-coil” que participan en su proceso de agregación. En esta tesis demostramos que esto también pasa en los PrLDs humanos y hemos caracterizado la proteína MED15 como ejemplo, mostrando que su PrLD forma fibras amiloides en un proceso mediado por su “coiled-coil”, hecho que puedo explicar su rol en enfermedad. En general, esta tesis es un estudio exhaustivo de las “prion-like proteins” i sus propiedades.

Prion-like proteins have attracted significant attention in the last years. The interest in these polypeptides owes to: i) their implication in degenerative diseases; ii) the presence of disease-causing mutations that increase the risk to develop the disease; iii) their ability to establish protein-protein interactions; and iv) their participation in membraneless organelles formation. Yeast prions are proteins with the ability to switch between a soluble an amyloid state as an adaptive mechanism to confront environmental changes. Most of the yeast prions have a disordered prion forming domain (PFD) of low complexity, enriched in Gln and Asn, and depleted of hydrophobic and charged residues. In order to discover novel yeast prions, computational tools were developed and further used to uncover proteins with domains similar to yeast PFDs in other proteomes, including human. These proteins were named prion-like, and their identified regions prion-like domains (PrLDs). PrLDs are similar in composition to yeast PFDs, and they share the ability to aggregate, replicate, and propagate. Cytoplasmic deposits of prion-like proteins have been observed in many degenerative diseases, and genetic mutations in their PrLD have been described. Most of the prion-like proteins are nuclear, but they translocate to the cytoplasm in disease conditions. This phenomenon has been associated with prion-like proteins aggregation into amyloid fibrils. Therefore, in this thesis we identified potential new prion-like proteins candidates and experimentally validated the region responsible for aggregation of seven of them. We also improve predictions for disease-causing mutations impact in prion-like proteins aggregation process. It was observed that prion-like proteins have the ability to form dynamic and reversible membraneless organelles, depending on the cellular conditions, for example, under stress. When these changes are too persistent, membraneless formation is not reversible anymore and they result in the appearance of the solid deposits recurrently observed in patients. We are still far from deciphering the exact mechanism of membraneless organelles formation. For this reason, in this thesis, we have studied the human prion-like protein hnRNPDL to try to expand the knowledge of this phenomenon and its connection to disease. We characterized hnRNPDL isoforms self-assembly properties demonstrating the importance of alternative splicing in controlling protein phase separation events, and show that D378N/H disease mutations accelerates hnRNPDL aggregation dramatically reducing its solubility in the muscle of Drosophila. Prion-like proteins are hubs of large protein-protein interaction networks through their PrLDs. Interestingly, a significant number of yeast PFDs have coiled-coil regions (CC) that participate in their aggregation process. We demonstrate here that this is also the case for human PrLDs and characterize the MED15 protein as an example, showing that its PrLD forms amyloid fibrils in a process mediated by its CC, which can account for its role in disease. In general, this thesis is an extensive study of prion-like proteins and their properties.