Asymmetric synthesis of chiral amines using transaminases: a multienzymatic approach by pyruvate decarboxylase coupling

Abstract

La present tesi es centra en el desenvolupament i optimització d’una estratègia basada en la biocatàlisi per a la síntesi d’amines quirals, les quals són compostos òpticament actius de gran valor que poden ésser utilitzats per a la síntesi de nombrosos productes, especialment en les indústries farmacèutica i agroquímica. Més concretament, es pretén sintetitzar 3-amino-1-fenilbutà (3-APB) i 1-feniletilamina (1-PEA) a través de la reacció en cascada de la transaminasa (TA) i la piruvat decarboxilasa (PDC). Aquesta cascada es basa en una síntesi asimètrica que parteix de les seves corresponents cetones proquirals i l’alanina, i és catalitzada per omega-transaminases, les quals presenten un equilibri desfavorable. Per tal de solucionar aquest problema, la PDC actua com un sistema d’eliminació de producte secundari, a través de la transformació del piruvat a acetaldehid i CO2, la qual cosa provoca un desplaçament de l’equilibri. Amb l’objectiu de superar les limitacions comercials de la PDC, la qual només es pot obtenir en petites quantitats a un cost alt, es va desenvolupar un procés sencer de producció d’aquest enzim. Es va clonar i sobreexpressar el gen de la PDC de Zymobacter palmae (ZpPDC) en Escherichia coli. Posteriorment, es va obtenir l’enzim recombinant en grans quantitats a través del desenvolupament d’un procés de cultiu d’alta densitat cel·lular en bioreactor. Pel que fa a les TAs, es disposava de quatre enzims diferents, procedents de Chromobacterium violaceum (Cvi-TA), Vibrio fluvialis (Vfl-TA) i Aspergillus terreus (Ate-TA i Ate-TA_T247S). Es va caracteritzar tant la PDC com les quatre transaminases per tal de trobar les condicions de compromís adequades per a la construcció de la cascada enzimàtica. Tenint en compte les condicions trobades, es va dur a terme, de forma preliminar, reaccions de cribratge de les quals en van sortir seleccionades la Cvi-TA i la Vfl-TA per a la síntesi de 3-APB; i Vfl-TA per a la síntesi de 1-PEA. Després de demostrar la viabilitat de la reacció en cascada de la TA i la PDC, es van aplicar diferents estratègies d’optimització per tal de maximitzar els rendiments de reacció i millorar la baixa estabilitat operacional de les transaminases. Per una banda, es van explorar algunes estratègies d’optimització de les condicions de reacció. Per l’altra, es va aplicar enginyeria del medi de reacció. Posteriorment, es va dur a terme d’immobilització dels enzims. Es van obtenir derivats immobilitzats tant de la Cvi-TA com de la Vfl-TA en suports de MANA-agarosa i epoxy-agarosa. En el cas de la PDC, es va desenvolupar un sistema innovador de purificació i immobilització simultània en MANA-agarosa. Finalment, els enzims immobilitzats obtinguts van ser aplicats en reacció i es va desenvolupar una estratègia de reacció en cicles.

La presente tesis se centra en el desarrollo y optimización de una estrategia basada en la biocatálisis para la síntesis de aminas quirales, las cuales son compuestos ópticamente activos de gran valor que pueden ser utilizados para la síntesis de numerosos productos, especialmente en las industrias farmacéutica y agroquímica. Más concretamente, se pretende sintetizar 3-amino-1-fenilbutano (3-APB) y 1-feniletilamina (1-PEA) a través de la reacción en cascada de la transaminasa (TA) y la piruvato decarboxilasa (PDC). Esta cascada se basa en una síntesis asimétrica que parte de sus correspondientes cetonas proquirales y la alanina, y es catalizada por omega-transaminasas, las que presentan un equilibrio desfavorable. Para solucionar este problema, la PDC actúa como un sistema de eliminación de producto secundario, a través de la transformación del piruvato en acetaldehído y CO2, lo que provoca un desplazamiento del equilibrio. Con el objetivo de superar las limitaciones comerciales de la PDC, la cual sólo se puede obtener en pequeñas cantidades a un coste alto, se desarrolló un proceso entero de producción de esta enzima. Se clonó y sobreexpresó el gen de la PDC de Zymobacter Palmae (ZpPDC) en Escherichia coli. Posteriormente, se obtuvo la enzima recombinante en grandes cantidades a través del desarrollo de un proceso de cultivo de alta densidad celular en bioreactor. En cuanto a las TAs, se disponía de cuatro enzimas diferentes, procedentes de Chromobacterium violaceum (Cvi-TA), Vibrio fluvial (Vfl-TA) y Aspergillus Terreus (Ate-TA y Ate-TA_T247S). Se caracterizó tanto la PDC como las cuatro transaminasas con el fin de encontrar las condiciones de compromiso adecuadas para la construcción de la cascada enzimática. Teniendo en cuenta las condiciones encontradas, se llevó a cabo, de forma preliminar, reacciones de cribado de las que salieron seleccionadas la Cvi-TA y la Vfl-TA para la síntesis de 3-APB; y Vfl-TA para la síntesis de 1-PEA. Tras demostrar la viabilidad de la reacción en cascada de la TA y la PDC, se aplicaron diferentes estrategias de optimización para maximizar los rendimientos de reacción y mejorar la baja estabilidad operacional de las transaminasas. Por un lado, se exploraron algunas estrategias de optimización de las condiciones de reacción. Por el otro, se aplicó ingeniería del medio de reacción. Posteriormente, se llevó a cabo de inmovilización de las enzimas. Se obtuvieron derivados inmovilizados tanto de la Cvi-TA como de la Vfl-TA en soportes de MANA-agarosa y epoxy-agarosa. En el caso de la PDC, se desarrolló un sistema innovador de purificación e inmovilización simultánea en MANA-agarosa. Finalmente, las enzimas inmovilizadas obtenidas fueron aplicadas en reacción y se desarrolló una estrategia de reacción en ciclos.

The present thesis is focused on the development and optimization of a biocatalytical approach for the synthesis of chiral amines, which are highly valuable optically active compounds that can be used for the synthesis of numerous targets, especially in pharmaceutical and agrochemical industry. More specifically, 3-amino-1-phenylbutane (3-APB) and 1-phenylethylamine (1-PEA) synthesis is pretended by the cascade reaction of transaminase (TA) and pyruvate decarboxylase (PDC). The mentioned cascade consists in an asymmetric synthesis from their corresponding prochiral ketones and alanine catalyzed by omega-transaminase, which presents an unfavorable equilibrium. To overcome this problem, PDC acts as a by product removing system by transforming the resulting pyruvate to acetaldehyde and CO2, which leads to an equilibrium shift. Aiming to overcome the low PDC commercial availability, which can only be acquired at low amounts and a high cost, a whole production process was developed. Zymobacter palmae PDC (ZpPDC) gene was cloned and overexpressed in Escherichia coli. After that, high amounts of the recombinant enzyme were obtained by the development of a high-cell density culture process in bench-top bioreactor. Regarding TA, four different enzymes were available from Chromobacterium violaceum (Cvi-TA), Vibrio fluvialis (Vfl-TA) and Aspergillus terreus (Ate-TA and Ate-TA_T247S). Both PDC and the different transaminases were characterized to find out the appropriate compromise conditions to construct the enzymatic cascade. Taking into account the found conditions, preliminary screening reactions were carried out, from which Cvi-TA and Vfl-TA were selected for the synthesis of 3-APB; and Vfl-TA for the synthesis of 1-PEA. After proving the feasibility of TA and PDC cascade reaction, different optimization approaches were applied in order to maximize reaction yields and to improve the low transaminase operational stability. On the one hand, reaction conditions optimization approaches were explored. On the other, reaction medium engineering was applied. After that, enzyme immobilization was carried out. Immobilized derivatives of both Cvi-TA and Vfl-TA were obtained in MANA-agarose and epoxy-agarose supports. In the case of PDC, an innovative simultaneous purification and immobilization process was developed using MANA-agarose. Finally, the obtained immobilized enzymes were applied in reactions and a reaction cycle strategy was developed.