Estudios fisicoquímicos de las construcciones tetraméricas de las secuencias peptídicas (11-25) de la proteína VP1 y (110-121) de la proteína VP3 del virus de la hepatitis A con modelos de membrana

Abstract

La hepatitis A es una enfermedad infecciosa aguda extendida a nivel mundial, y que a pesar de no ser grave, conlleva unos elevados gastos sanitarios y afecta anualmente a 1.4 millones de personas. Puesto que las vacunas existentes, basadas en vírus inactivados, son muy caras, existe un elevado interés en el desarrollo de vacunas igualmente efectivas y seguras, pero de coste suficientemente bajo para hacerlas accesibles a los países subdesarrollados, donde la enfermedad se encuentra más extendida. Por otra parte, la mayoría de péptidos y proteínas con actividad biológica, incluyendo los antígenos peptfdicos, adquieren su conformación bioactiva al interaccionar con la membrana celular, concretamente con el entorno anfipático de la bicapa lipídica. Por ello, el estudio de la interacción péptido lípido utilizando modelos sintéticos de membrana es de gran interés para determinar las bases estructurales que definen la actividad biológica. Teniendo en cuenta estos antecedente_s, en esta tesis se pretende establecer las bases para el desarrollo de una vacuna sintética contra el virus de la hepatitis A basada en péptidos sintéticos.

Los objetivos específicos son los siguientes:

1. Sintetizar antígenos peptídicos múltiples. (MAPs) basados en varias copias de una misma secuencia peptídica correspondiente a una proteína del virus de la hepatitis A. Se seleccionaransecuencias antigénicas de las proteínas VP1 y VP3 del cápside del virus, y se prepararán construcciones de cuatro de estas secuencias unidas por un núcleo ramificado de resíduos de lisina. De esta manera, se persigue incrementar la capacidad antigénica de las secuencias peptídicas sin necesidad de administrarlas conjuntamente con proteínas u otras sustancias inmunoadyuvantes.

2. Estudiar la interacción de estos antígenos peptidicos múltiples con modelos sintéticos de membrana: monocapas en la interfase agua/aire y vesículas lipídicas unilarninares. A diferencia de las membranas biológicas, que presentan gran complejidad, los modelos sintéticos propuestos presentan importantes ventajas, como su simplicidad y la posibilidad de controlar variables como1a compos ición, la curvatura, la presión lateral, etc., aspectos todos ellos de gran relevancia en la interacción de epítopos peptídicos con las membranas celulares. Se prepararán modelos de membrana de tres composiciones, con carga neta positiva, negativa o zwitterionica, a fin de elucidar los componentes electrostático e hidrofóbico en la interacción lípido-péptido.

2.1. La miscibilidad de los componentes lipídicos de los modelos de membrana seleccionados se determinará mediante la técnica de la balanza de Langmuir. 2.2. Monocapas extendidas en la interfase agua/aire: mediante la técnica de la balanza de Langp1uir, nos proponemos caracterizar la interacción de los MAPs sintetizados realizando estudios de penetración en la interfase a diferentes presiones superficiales, así como isotermas de compresión de monocapas mixtas péptido/lípido. 2.3. Vesículas lipídicas unilaminares (liposomas): se aplicará una batería de técnicas espectroscópicas para determinar la interacción de los MAPs con liposomas de las mismas composiciones empleadas en la preparación de las monocapas. Concretamente, se realizarán estudios de fluorescencia intrínseca y extrlnseca, de transferencia de energía por resonancia y de polarización de fluorescencia para determinar la unión de los péptidos a las membranas así como los posibles cambios en las propiedades fisicoquímicas de las mismas. La información obtenida podría aplicarse también al disefio de una vaclma sintética donde los MAPs se administrasen incorporados en liposomas, de manera que los epítopos adoptasen la conformación activa que facilitase su reconocimiento por las células del sistema inmune.