Shaping endometrial cancer diagnosis via the identification of protein biomarkers in gynecological fluids

Abstract

El càncer d’endometri (CE) és el sisè tumor més comú en dones a tot el món, amb 417.367 casos nous i 97.370 morts el 2020. El diagnòstic precoç del CE s’associa amb el 95% de la taxa de supervivència als 5 anys, mentre que el diagnòstic avançat la redueix al 17%. Actualment, no existeix cap prova de cribratge per a la detecció precoç del CE. Només les dones que presenten els símptomes clàssics del CE, principalment un sagnat uterí anormal (SUA), inicien el llarg procés de diagnòstic del CE, basat en l’obtenció invasiva de biòpsies endometrials. Això suposa una gran càrrega per a la salut femenina, ja que el SUA és un símptoma molt poc específic. Per tant, el desenvolupament i la implementació d’una prova no invasiva per distingir les condicions benignes dels CE urgeix. A més del diagnòstic, les biòpsies endometrials haurien de proporcionar informació sobre la histologia i grau tumorals per avaluar del risc preoperatori en pacients amb CE, utilitzat per guiar el tractament quirúrgic. Malauradament, el limitat material contingut en les biòpsies i l’elevada variabilitat en la interpretació patològica entre especialistes resulta en un 11% i 27% de discordances entre el diagnòstic preoperatori i el final en la determinació del tipus i grau histològic, respectivament. Per tant, la mesura objectiva dels factors pronòstics i/o la identificació de nous biomarcadors pronòstics també són urgents per guiar un tractament quirúrgic òptim en pacients amb CE. L’objectiu d’aquesta tesi és posicionar els fluids ginecològics, com les biòpsies líquides uterines i els fluids cervicals, com a font de biomarcadors de CE altament sensibles i específics. En aquesta tesi, hem volgut identificar biomarcadors altament sensibles, específics i reproduïbles que millorin el diagnòstic i l’avaluació del risc preoperatori dels tumors endometrials en fluids ginecològics, seguint dos enfocs diferents. El primer va ser investigar el fluid de les biòpsies pipelle, és a dir, els fluids uterins, com a font de biomarcadors de tipus i grau histològic, així com la predicció de recurrència. Per aconseguir-ho, vam realitzar una extensa revisió literària identificant 255 proteïnes, 30 de les quals es van validar en un anàlisi in-silico. Paral·lelament, vam generar una biblioteca espectral amb el proteoma dels fluids uterins (n= 42 CE) que posteriorment es va utilitzar per realitzar un estudi clínic retrospectiu en fluids uterins de 149 pacients amb CE quantificats per espectrometria de masses (EM) d’adquisició independent de les dades. L’estudi va permetre definir panells de 2 proteïnes que permeten el diagnòstic del tipus histològic amb sensibilitats que oscil·len entre el 90,9-100%, grau histològic amb una sensibilitat del 85,3%, i predir recurrència amb sensibilitats entre el 85,7-100%. Per avançar en el diagnòstic del CE, el segon enfocament es va dirigir a la identificació de biomarcadors proteics en fluids cervicals pel diagnòstic precís i no invasiu del CE. Vam realitzar dos estudis clínics retrospectius utilitzant els fluids cervicals, incloent un estudi de descobriment amb 59 pacients i un estudi de verificació amb 241 pacients mitjançant EM. Com a resultat, vam identificar biomarcadors de diagnòstic de CE i vam desenvolupar panells proteics que diagnostiquen el CE amb una sensibilitat del 95,4%. Adicionalment, vam identificar panells proteics per determinar el tipus i el grau histològic amb AUC de 0,91 i 0,97, respectivament. S’espera que els resultats d’aquesta tesi generin un canvi de paradigma en el maneig de les dones que pateixen SUA i millorin la detecció precoç del CE. Hem identificat panells de proteïnes que permeten una avaluació objectiva i més precisa del risc preoperatori per a pacients amb CE en fluids uterins i que permeten desenvolupar un diagnòstic de CE precís, objectiu i no invasiu basat en fluids cervicals.

El cáncer de endometrio (CE) es el sexto tumor más común en mujeres a nivel mundial, con 417.367 nuevos casos y 97.370 muertes en 2020. El diagnóstico temprano del CE se asocia con el 95% de la tasa de supervivencia a los 5 años, mientras que el diagnóstico avanzado la reduce hasta el 17%. Actualmente no existe ninguna prueba de cribado para la detección precoz del CE. Solo las mujeres que presentan los síntomas clásicos del CE, principalmente un sangrado uterino anormal (SUA), inician el largo proceso de diagnóstico del CE, basado en la obtención invasiva de biopsias endometriales. Esto representa una gran carga para la salud de la mujer, ya que el SUA es un síntoma muy inespecífico. Por lo tanto, urge el desarrollo y la implementación de una prueba no invasiva para distinguir las patologías benignas de los CE. Además del diagnóstico, las biopsias endometriales deben proporcionar información sobre la histología y grado tumorales para evaluar el riesgo preoperatorio en pacientes con CE, utilizado para guiar el tratamiento quirúrgico. Desafortunadamente, el limitado material contenido en las biopsias y la alta variabilidad en la interpretación patológica entre especialistas resulta en un 11% y 27% de discordancias entre el diagnóstico preoperatorio y el final en la determinación del tipo histológico y grado, respectivamente. Por lo tanto, la medición objetiva de los factores pronósticos y/o la identificación de nuevos biomarcadores pronósticos también se necesita con urgencia para guiar un tratamiento quirúrgico óptimo en pacientes con CE. El objetivo de esta tesis es posicionar los fluidos ginecológicos, como las biopsias líquidas uterinas y los fluidos cervicales, como fuente de biomarcadores de CE altamente sensibles y específicos. En esta tesis, nuestro objetivo fue identificar biomarcadores altamente sensibles, específicos y reproducibles que mejoraran el diagnóstico y la evaluación del riesgo preoperatorio de tumores endometriales en fluidos ginecológicos, siguiendo dos enfoques diferentes. El primero fue investigar el fluido de las biopsias pipelle, es decir, los fluidos uterinos, como fuente de biomarcadores de tipo y grado histológico, y predicción de recurrencia. Para lograrlo, realizamos una extensa revisión literaria identificando 255 proteínas, 30 de las cuales fueron validadas en un análisis in-silico. Paralelamente, generamos una biblioteca espectral con el proteoma de fluidos uterinos (n=42 CE) que posteriormente se utilizó para realizar un estudio clínico retrospectivo en fluidos uterinos de 149 pacientes con CE cuantificados mediante espectrometría de masas (EM) de adquisición independiente de datos. El estudio permitió definir paneles de 2 proteínas que permiten el diagnóstico de tipo histológico con sensibilidades entre el 90,9-100%, grado histológico con sensibilidad del 85,3%, y predicen recurrencia con sensibilidades del 85,7-100%. Para avanzar en el diagnóstico del CE, el segundo enfoque se dirigió a identificar biomarcadores proteicos en los fluidos cervicales para diagnosticar el CE de manera precisa y no invasiva. Realizamos dos estudios clínicos retrospectivos sobre fluidos cervicales, incluyendo un estudio de descubrimiento de 59 pacientes y un estudio de verificación de 241 pacientes mediante EM. Como resultado, identificamos biomarcadores de diagnóstico de CE y desarrollamos paneles de proteínas que diagnostican el CE llegando a una sensibilidad del 95,4%. Además, también identificamos paneles de proteínas para determinar el tipo histológico y el grado con AUCs de 0,91 y 0,97, respectivamente. Se espera que los resultados de esta tesis generen un cambio de paradigma en el manejo de las mujeres que sufren SUA y mejoren la detección temprana del CE. Identificamos paneles de proteínas que permiten una evaluación objetiva y más precisa del riesgo preoperatorio para pacientes con CE en fluidos uterinos, y que permiten el desarrollo de un diagnóstico preciso, objetivo y no invasivo del CE basado en fluidos cervicales.

Endometrial cancer (EC) is the sixth most common tumor in women worldwide, with 417,367 new cases and 97,370 deaths in 2020. Early diagnosis of EC is associated with 95% of 5-year survival rate, while advanced diagnosis drops the survival rate down to 17%. Today, there is no screening test for the early detection of EC. Only women presenting the classic symptoms of EC, i.e., mainly an abnormal uterine bleeding (AUB), start the multistep process of EC diagnosis, which relies on the invasive acquisition of endometrial biopsies. This accounts for a huge burden for women’s health since AUB is a highly unspecific symptom. Therefore, the development and implementation of a non-invasive test to distinguish benign from malignant conditions is urgently needed. In addition to diagnosis, endometrial biopsies should provide information regarding tumor histology and tumor grade to provide the pre-operative risk assessment in EC patients, which is used to guide the surgical treatment. Unfortunately, the limited material contained in endometrial biopsies and the high inter-observer variability in the pathological interpretation, results in 11% and 27% of discordances in the determination of EC histological type and grade, respectively, between preoperative and final diagnosis. Thus, the objective measurement of prognostic factors and/or the identification of novel prognostic biomarkers is as well urgently needed to guide an optimal EC surgical treatment. This thesis was performed aiming to position gynecological fluids, such as uterine liquid biopsies and cervical fluids, as a source of highly sensitive and specific EC biomarkers. In this thesis, we aimed to identify highly sensitive, specific, and reproducible biomarkers that improve the diagnosis and pre-operative risk assessment of EC tumors in gynecological fluids, following two different approaches. The first was to investigate the fluid of pipelle biopsies i.e., uterine fluids, as a source of biomarkers of histological type and grade, and recurrence prediction. To achieve this, we performed an extensive literature review identifying 255 proteins, 30 of which were further validated in an in-silico analysis. In parallel, we generated a spectral library with the proteome of uterine fluids (n=42 EC) that was subsequently used to conduct a clinical retrospective study in uterine fluids of 149 EC patients quantified by data-independent acquisition mass spectrometry (MS). The study allowed us to define panels of 2 proteins that allow diagnosis of histological type with sensitivities ranging from 90.9-100%, histological grade with sensitivity of 85.3%, and predict recurrence with sensitivities ranging from 85.7-100%. As a step towards advancing on EC diagnosis, the second approach was directed to investigate on the identification of protein biomarkers in cervical fluids to accurately and non-invasively diagnose EC. We conducted two clinical retrospective studies on cervical fluids, including a discovery study of 59 patients and a verification study of 241 patients by MS approaches. As a result, we identified EC diagnostic biomarkers and developed protein signatures that accurately diagnose EC with a sensitivity of 95.4%. Additionally, we also identify protein signatures to determine the histological type and grade with AUCs of 0.91 and 0.97, respectively. The results of this thesis are expected to generate a change in the paradigm on how clinicians manage women suffering from AUB, and to improve early detection of EC. We identified protein signatures that permit an objective and more accurate preoperative risk assessment for EC patients in uterine fluids, and that allow the development of a non-invasive, accurate and objective EC diagnosis based on cervical fluids.