The Small GTPase RHOA in cancer

Abstract

RhoA és una proteïna GTPasa amb un paper rellevant en importants processos cel·lulars. Els nivells d’expressió de RhoA i/o la seva activitat es troben alterats en molts tipus de càncer, però curiosament s’han trobat mutacions recurrents i específiques de tumor en càncer gàstric de tipus difús (CGD), carcinoma de cèl·lules escamoses de cap i coll (CCECC), limfoma de Burkitt, leucèmia/limfoma T de l’adult i limfoma T angioimmunoblàstic, suggerint un paper diferent y depenent de tumor per cada proteïna mutant. En aquest treball hem caracteritzat a nivell funcional set de les mutacions recurrents en RHOA. Els nostres resultats indiquen que, alguns dels mutants exhibeixen una disminució en l’estabilitat de la proteïna i una localització predominant al nucli en comparació amb la proteïna RhoA nativa. A més, l’avaluació dels efectes de la sobreexpressió de les formes de RhoA mutades en l’organització del citoesquelet va mostrar una reducció general en la formació de filaments d’actina i una major capacitat d’adhesió a substrat. Finalment, la majoria dels mutants estudiats mostraren una senyalització depenent de les vies NFkB i del factor de resposta sèrica reduïda. Per conèixer els mecanismes moleculars desregulats per les mutacions de RhoA, s’avaluà l’interactoma. La capacitat d’unió de les diferents proteïnes mutants de RhoA a Rhotekina resultà ser depenent de la seva estabilitat proteica. A més, l’avaluació de la interacció entre les diferents proteïnes RhoA i els seus efectors més comuns mitjançant un sistema de doble híbrid en llevat, demostrà la incapacitat de tots els mutants de DGC estudiants d’unir PKN1. Tanmateix, el mutant de CCECC RhoA E40Q resultà deficient en la unió a NET1 y kinectina. El CCECC és un grup molt heterogeni de càncers. Les mancances en la millora de la supervivència i en els tractaments personalitzats han promogut la investigació activa dels mecanismes moleculars associats al seu desenvolupament. Encara que RHOA està mutat en només l’1,5% dels pacients de CCECC, més del 60% d’aquestes mutacions succeeixen a E40Q, el que suggereix un paper determinant en el procés de carcinogènesi. L’avaluació immunohistoquímica dels nivells de RhoA en mostres de teixit de CCECC va indicar que l’expressió de RhoA s’associa amb una pitjor supervivència en pacients amb tumors de laringe específicament. Per estudiar el paper de RhoA nativa a CCECC, es van generar línies cel·lulars isogèniques deplecionades de RHOA mitjançant ARN d’interferència (RHOA KD) i inactivació genètica mitjançant la tecnologia CRISPR/Cas9 (RHOA KO). Els resultats van mostrar un alentiment del creixement cel·lular in vitro i in vivo, així com una disminució del potencial de migració in vitro en línies cel·lulars tumorals derivades de llengua i laringe. Aquests resultats confirmen que RHOA actua com un oncogèn a CCECC. Seguidament, es va avaluar el paper de la mutació E40Q en sistemes cel·lulars de sobreexpressió de RhoA de manera induïble amb doxiciclina. Sorprenentment, la sobreexpressió de RhoA nativa o E40Q en cèl·lules de faringe va reduir el creixement cel·lular in vitro. Per tant, vam decidir reintroduir RhoA nativa o E40Q en els sistemes cel·lulars de llengua i laringe RHOA KD i RHOA KO generats prèviament. Curiosament, la reintroducció de RhoA nativa i E40Q no va afectar el creixement cel·lular ni les capacitats de migració de les cèl·lules. En conjunt, la complexitat del patró mutacional de RHOA sense precedents, específic del tipus de tumor, i els nostres resultats, mostren que els diferents mutants de RhoA presenten diferents papers oncogènics. A més, demostrem que RhoA a CCECC proporciona un avantatge de creixement per a les cèl·lules tumorals que donen suport al possible paper oncogènic en aquest tipus tumoral.

RhoA es una proteína GTPasa con un papel relevante en importantes procesos celulares. Los niveles de expresión de RhoA y/o su actividad se encuentran alterados en muchos tipos de cáncer, pero curiosamente, se han encontrado mutaciones recurrentes y específicas de tumor en cáncer gástrico de tipo difuso (CGD), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), linfoma de Burkitt, leucemia/linfoma T del adulto y linfoma T angioinmunoblástico, sugiriendo un papel distinto y dependiente de tumor para cada proteína mutante. En este trabajo hemos caracterizado a nivel funcional siete de las mutaciones recurrentes en RHOA. Nuestros resultados indican que, algunos de los mutantes exhiben una disminución en la estabilidad de la proteína y una localización predominante en el núcleo en comparación con la proteína RhoA nativa. Además, la evaluación de los efectos de la sobreexpresión de las formas de RhoA mutadas en la organización del citoesqueleto mostró una reducción general en la formación de filamentos de actina, y una mayor capacidad de adhesión a sustrato. Finalmente, la mayoría de los mutantes estudiados mostraron una señalización dependiente de las vías NFkB y del factor de respuesta sérica reducida. Para conocer los mecanismos moleculares desregulados por las mutaciones de RhoA, se evaluó su interactoma. La capacidad de unión de las diferentes proteínas mutantes de RhoA a Rhotekina resultó ser dependiente de su estabilidad proteica. Además, la evaluación de a interacción entre las diferentes proteína RhoA y sus efectores más comunes mediante un sistema de doble híbrido en levadura, demostró la incapacidad de todos los mutantes de DGC estudiados de unir a PKN1. Sin embargo, el mutante de CCECC RhoA E40Q resultó deficiente en la unión a NET1 y kinectina. El CCECC es un grupo muy heterogéneo de cánceres. Las carencias en la mejora de la supervivencia y en los tratamientos personalizados han promovido la investigación activa de los mecanismos moleculares asociados su desarrollo. Aunque RHOA está mutado sólo en el 1,5% de los pacientes de CCECC, más del 60% de estas mutaciones ocurren en E40Q, lo que sugiere un papel determinante en el proceso de carcinogénesis. La evaluación inmunohistoquímica de los niveles de RhoA en muestras de tejido de CCECC indicó que la expresión de RhoA se asocia con una peor supervivencia en pacientes con tumores de laringe específicamente. Para estudiar el papel de RhoA nativa en CCECC, se generaron líneas celulares isogénicas deplecionadas de RHOA mediante ARN de interferencia (RHOA KD) e inactivación genética mediante la tecnología CRISPR/Cas9 (RHOA KO). Los resultados mostraron una ralentización del crecimiento celular in vitro e in vivo, así como una disminución del potencial de migración in vitro en líneas celulares tumorales derivadas de lengua y laringe. Estos resultados confirman que RHOA actúa como un oncogén en CCECC. Seguidamente, se evaluó el papel de la mutación E40Q en sistemas celulares de sobreexpresión de RhoA de manera inducible con doxiciclina. Sorprendentemente, la sobreexpresión de RhoA nativa o E40Q en células de faringe redujo el crecimiento celular in vitro. Por consiguiente, decidimos reintroducir RhoA nativa o E40Q en los sistemas celulares de lengua y laringe RHOA KD y RHOA KO generados previamente. Curiosamente, la reintroducción de RhoA nativa y E40Q no afectó el crecimiento celular ni las capacidades de migración de las células. En conjunto, la complejidad del patrón mutacional de RHOA sin precedentes, específico del tipo de tumor, y nuestros resultados muestran que los distintos mutantes de RhoA presentan diferentes papeles oncogénicos. Además, demostramos que RhoA en CCECC proporciona una ventaja de crecimiento para las células tumorales que apoyan el posible papel oncogénico en este tipo tumoral.

RhoA is a small GTPase with an important role in key cellular processes. RhoA expression levels and/or activity are altered in multiple cancers, but interestingly, recurrent and tissue-specific hotspot mutations have been recently identified in diffuse gastric cancer (DGC), head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), Burkitt lymphoma, adult T-cell leukemia/lymphoma and angioimmunoblastic T-cell lymphoma, suggesting a distinctive and tumor-dependent role of each mutant protein. In this work, seven recurrent RHOA mutations have been functionally characterized. Our results indicate that some RhoA mutants display lower protein stability and a predominant nuclear localization compared to the wild-type (wt) RhoA. Moreover, the evaluation of the effects of mutant RhoA overexpression on the cytoskeleton organization showed a general reduction in the formation of actin filaments, and a higher cell adhesion capacity. Finally, we observed a reduced NFkB and serum response factor signaling in most of the hotspot RhoA mutants studied. To dissect the molecular mechanisms deregulated due to RhoA mutations, we investigated the protein interactome. Binding of the different RhoA mutants to Rhotekin effector protein trough a pull-down assay was dependent on RhoA protein levels. A yeast-two-hybrid system approach between RhoA forms and the most common RhoA effector proteins, evidenced that all the studied DGC mutants were unable to bind to PKN1; whereas, the HNSCC hotspot mutant RhoA E40Q failed to bind to NET1 and kinectin. HNSCC is a very heterogeneous group of cancers. The lack of survival improvement and personalized treatments has promoted an active research into the molecular mechanisms of HNSCC. RHOA is mutated only in around of 1.5% of the HNSCC cases, but interestingly, more than 60% of these mutations occur in E40Q, suggesting a possible active role in the tumorigenic process. Immunohistochemical analysis of RhoA expression in HNSCC tissue microarray indicated that RHOA expression is associated with shorter survival outcomes in patients with larynx tumors. To study the role of wt RhoA in HNSCC, we engineered isogenic cell line systems downregulated for RHOA through the directed targeting of RHOA by shRNA (RHOA KD) and by CRISPR/Cas9 technology (RHOA KO). Results showed an impairment of cell growth in vitro and in vivo, as well as a decrease of the migration potential in vitro, both in tongue and larynx-derived tumor cell lines. These results confirm that RHOA acts as an oncogene in HNSCC. Next, the role of E40Q hotspot mutation was evaluated in doxycycline-inducible RhoA overexpressing cell systems. Surprisingly, RhoA wt or E40Q overexpression in pharynx cells reduced cell growth in vitro. Hence, we decided to re-introduce RhoA wt or E40Q in tongue and larynx cell lines RHOA KD and RHOA KO cell systems. Intriguingly, the reintroduction of RhoA wt and E40Q did not affect cell growth and migration capabilities of the cells. Altogether, the unprecedented tumor-type-dependent complexity in the mutational landscape of RhoA and our results indicate that the different RhoA hotspot mutations exhibit different oncogenic roles. Furthermore, specifically in HNSCC we demonstrate that RhoA provides a growth advantage for the cancer cells supporting a possible oncogenic role of RhoA in this tumor type.