Metabolic engineering of Pichia pastoris for 3-hydroxypropionic acid production from glycerol

Abstract

L’àcid 3-hidroxipropiònic (3-HP), un producte plataforma, ha estat identificat com un dels productes de valor afegit més prometedors per ser obtinguts a partir de biomassa pel Departament d’Energia dels Estats Units. En conseqüència, en els darrers anys, els estudis centrats en la bioproducció de 3-HP han guanyat una atenció notable. Fins ara, s’ha informat de la producció de 3-HP per a la revalorització de múltiples fonts de carboni utilitzant diversos microorganismes. Aquesta tesi s’emmarca en un projecte per aconseguir produir 3-HP a partir de glicerol en Pichia pastoris (Komagataella phaffii). Aquest llevat metilotròfic és capaç de créixer consumint el glicerol cru provinent de la indústria del biodièsel i pot créixer a un pH baix, facilitant la posterior purificació del 3-HP. L’expressió de la via del malonil-CoA al 3-HP, codificada pel gen de la malonil-CoA reductasa (mcr) de Chloroflexus aurantiacus, en P. pastoris va donar lloc a la producció de 3-HP amb rendiments baixos (0.01 Cmol/Cmol, soca PpHP1). Posteriorment, estretègies d’enginyeria enzimàtica i metabòlica dirigides a augmentar la disponibilitat de cofactors i precursors metabòlics van permetre augmentar 14 vegades el rendiment de producció de 3-HP en comparació amb la soca inicial (0.14 Cmol/Cmol, soca PpHP6). En particular, aquest rendiment va ser lleugerament superior als que s’han descrit anteriorment utilitzant altres llevats que expressaven la mateixa via heteròloga, com Saccharomyces cerevisiae o Schyzosaccharomyces pombe (0.12 Cmol/Cmol en ambdós llevats). Això suggereix que el perfil Crabtree negatiu de P. pastoris permet una millor conservació del carboni i un menor malbaratament energètic a través de vies fermentatives. A més, la força del promotor constitutiu pGAP en P. pastoris va provocar que l’activitat específica de MCR fos notablement més alta en comparació amb el promotor pTEF1 en S. cerevisiae (0.30 U/mgproteïna i 0.008 U/mgproteïna, respectivament). Es va realitzar un segon cicle d’enginyeria metabòlica amb l’objectiu d’augmentar el subministrament de malonil-CoA. Es va afegir una segona còpia del gen que codifica el domini C-terminal de MCR (soca PpHP8). La sobreexpressió de la via endògena de producció d’acetil-CoA citosòlic i la supressió de la reacció que produeix el subproducte D-arabitol a la soca PpHP8 va donar lloc a la soca PpHP18. Mentre que la segona còpia del domini C-terminal de MCR (PpHP8) va produir la soca amb un rendiment més alt (0.18 Cmol/Cmol), la soca PpHP18 va mostrar un rendiment de producció inferior (0.15 Cmol/Cmol), mentre que la seva taxa de creixement màxim (µmax) va ser més alta (0.17 h-1 enfront de 0.13 h-1) en cultius a petita escala. Es va portar a terme una anàlisi dels fluxos metabòlic basada en 13C (13C-MFA) utilitzant una plataforma robotitzada d’alt rendiment (High Throughput) per experiments de fluxòmica. Els resultats apunten que el control estricte del flux glicolític en el llevat Crabtree negatiu P. pastoris provoca l’esgotament d’acetil-CoA, donant lloc a limitacions en els recursos per al creixement cel·lular de la soca PpHP8, però rendiments més elevats de 3-HP. Els resultats de 13C-MFA també mostren com els fluxos de la via de la glicòlisi superior i de la via de les pentoses fosfat a la soca PpHP18 es van incrementar molt, cosa que apunta a un malbaratament considerable d’ATP. Això podria explicar el menor rendiment en la producció de 3-HP observat a la soca PpHP18 a la velocitat màxima de creixement. El cultiu en discontinu alimentat (fed-batch) de la soca PpHP8 i PpHP18 van mostrar que la productivitat de la soca PpHP18 va ser notablement superior a la productivitat de la soca PpHP8 (0.71 g/L/h en comparació amb 0.62 g/L/h). La productivitat volumètrica i la concentració final de 3-HP aconseguides són els valors més alts descrits en llevats fins ara.

El ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP), un producto plataforma, ha sido identificado como uno de los productos de valor añadido más prometedores para ser obtenidos a partir de biomasa por el Departamento de Energía de los Estados Unidos. En consecuencia, en los últimos años, los estudios centrados en la bioproducción de 3-HP han ganado una atención notable. Hasta la fecha, se ha reportado la producción de 3-HP para la revalorización de múltiples fuentes de carbono utilizando varios microorganismos. Esta tesis se enmarca en un proyecto para conseguir producir 3-HP a partir de glicerol en Pichia pastoris (Komagataella phaffii). Esta levadura metilotrófica es capaz de crecer consumiendo el glicerol crudo proveniente de la industria del biodiésel y puede crecer a un pH bajo, facilitando la posterior purificación del 3-HP. La expresión de la vía del malonil-CoA al 3-HP, codificada por el gen de la malonil-CoA reductasa (mcr) de Chloroflexus aurantiacus, en P. pastoris dio lugar a la producción de 3-HP con rendimientos bajos (0.01 Cmol/Cmol, cepa PpHP1). Posteriormente, estrategias de ingeniería enzimática y metabólica dirigidas a aumentar la disponibilidad de cofactores y precursores metabólicos permitieron aumentar 14 veces el rendimiento de producción de 3-HP en comparación con la cepa inicial (0.14 Cmol/Cmol, cepa PpHP6). En concreto, este rendimiento fue ligeramente superior a los descritos anteriormente utilizando otras levaduras que expresaban la misma vía heteróloga, como Saccharomyces cerevisiae o Schyzosaccharomyces pombe (0.12 Cmol/Cmol en ambas levaduras). Esto sugiere que el perfil Crabtree negativo de P. pastoris permite una mejor conservación del carbono y un menor derroche energético a través de vías fermentativas. Además, la fuerza del promotor constitutivo pGAP en P. pastoris provocó que la actividad específica de MCR fuera notablemente más alta en comparación con el promotor pTEF1 en S. cerevisiae (0.30 U/mgproteína y 0.008 U/mgproteína, respectivamente). Se realizó un segundo ciclo de ingeniería metabólica con el objetivo de aumentar el suministro de malonil-CoA. Se añadió una segunda copia del gen que codifica el dominio C-terminal de MCR (cepa PpHP8). La sobrexpresión de la vía endógena de producción de acetil-CoA citosólico y la supresión de la reacción que produce el subproducto D-arabitol en PpHP8 dio lugar a la cepa PpHP18. Mientras que la introducción de la segunda copia del dominio C-terminal de MCR (PpHP8) produjo la cepa con un rendimiento más alto (0.18 Cmol/Cmol), la cepa PpHP18 mostró un rendimiento de producción inferior (0.15 Cmol/Cmol), aunque su tasa de crecimiento máximo (µmax) fue más alta (0.17 h-1 frente a 0.13 h-1) en cultivos a pequeña escala. Se llevó a cabo un análisis de los flujos metabólicos basado en 13C (13C-MFA) utilizando una plataforma robotizada de alto rendimiento (High Throughput) para experimentos de fluxómica. Los resultados apuntan a que el control estricto del flujo glicolítico en la levadura Crabtree negativa P. pastoris provoca el agotamiento de acetil-CoA, dando lugar a limitaciones en los recursos para el crecimiento celular de la cepa PpHP8, pero rendimientos más elevados de 3-HP. Los resultados de 13C-MFA también muestran como los flujos de la vía de la glicólisis superior y de la vía de las pentosas fosfato de la cepa PpHP18 se incrementaron mucho, cosa que apunta a un derroche considerable de ATP. Esto podría explicar el menor rendimiento en la producción de 3-HP observado en PpHP18 a la velocidad máxima de crecimiento. Los cultivos en discontinuo alimentado (fed-batch) de PpHP8 y PpHP18 mostraron que la productividad de la cepa PpHP18 fue notablemente superior a la productividad de PpHP8 (0.71 g/L/h en comparación con 0.62 g/L/h). La productividad volumétrica y la concentración final de 3-HP conseguidas son los valores más altos descritos en levaduras hasta la fecha.

3-hydroxypropionic acid (3-HP), a platform chemical, has been identified as one of the top value-added products to be produced from biomass by the US Energy Department. Consequently, 3-HP bioproduction has gained remarkable attention in recent years. So far, production of 3-HP for revalorization of multiple carbon sources has been reported using a variety of microorganisms. In this thesis, the yeast Pichia pastoris (Komagataella phaffii) has been metabolically engineered to produce 3-HP using glycerol as substrate.This methylotrophic yeast is able to grow on crude glycerol from the biodiesel industry and can grow at a low pH, facilitating the downstream processing of 3-HP. Expression of the malonyl-CoA to 3-HP pathway, encoded in the malonyl-CoA reductase gene (mcr) from Chloroflexus aurantiacus in P. pastoris resulted in 3-HP production at low yields on glycerol (0.01 Cmol/Cmol, strain PpHP1). Further enzyme and metabolic engineering approaches aimed at increasing the cofactor and metabolic precursors availability allowed for a 14-fold increase in the production of 3-HP compared to the starting strain (0.14 Cmol/Cmol, strain PpHP6). Notably, this yield was slightly higher to those previously reported using other yeasts with the same heterologous pathway, such as Saccharomyces cerevisiae or Schyzosaccharomyces pombe (0.12 Cmol/Cmol in both yeasts). This suggests that the Crabtree negative profile of P. pastoris allows a better conservation of carbon and a lower energy waste through fermentative pathways. In addition, the strength of the constitutive pGAP promoter in P. pastoris led to a remarkably higher MCR specific activity compared to pTEF1 in S. cerevisiae (0.30 U/mgprotein and 0.008 U/mgprotein, respectively). A second metabolic engineering cycle was performed, aiming at increasing the malonyl-CoA supply. To this end, a second copy of the gene encoding the C-terminal domain of MCR was added (strain PpHP8). In addition, the overexpression of the endogenous cytosolic acetyl-CoA production pathway and the deletion of the reaction producing the by-product D-arabitol in strain PpHP8 yielded the strain PpHP18. While the second copy of the C-terminal domain of MCR (PpHP8) yielded the highest producing strain (0.18 Cmol/Cmol), strain PpHP18 showed a lower production yield (0.15 Cmol/Cmol), while its maximal growth rate (µmax) was higher (0.17 h-1 compared to 0.13 h-1) in small-scale cultivations. To further characterize this series of strains, 13C-based Metabolic Flux Analysis (13C-MFA) was performed using a high throughput fluxomics robotic platform. The results point at the tight control of the glycolytic flux in Crabtree negative yeast P. pastoris causing depletion of acetyl-CoA, resulting in reduced resources for cell growth of strain PpHP8, but higher 3-HP yields. 13C-MFA also shows how the upper glycolysis and pentose phosphate pathway fluxes in strain PpHP18 were highly increased, pointing at a considerable waste of ATP, which might explain the lower 3-HP yield observed in strain PpHP18 at maximal growth rate. Fed-batch cultures of strains PpHP8 and PpHP18 were performed at a pre-programmed constant growth rate of 0.075 h-1. In contrast to the strain rankings observed in small scale cultures, final 3-HP titer obtained for the strain PpHP18 was higher (37.05 g/L, 0.20 Cmol/Cmol) than in PpHP8 (35.4 g/L, 0.18 Cmol/Cmol). Moreover, productivity of strain PpHP18 was remarkably higher than productivity of strain PpHP8 (0.71 g/L/h compared to 0.62 g/L/h), due to the higher growth rate of PpHP18, which led to a shorter batch phase. The volumetric productivity and the final 3-HP concentration achieved herein are the highest values reported in yeast to date, showing the great potential of P. pastoris to produce 3-HP.