Rational design of tryptophan synthases through conformation and correlation-based allosteric networks

Abstract

ENG- Enzymes are remarkable biological catalysts that operate under mild conditions with high specificity and efficiency. The improvement of enzyme performance is often achieved through experimental methods like Directed Evolution (DE), which can produce highly efficient variants but is costly, time-consuming, and does not often provide an explanation of why certain mutations work better. Computational enzyme design is emerging as a powerful alternative, offering the ability to predict and rationalize the effects of mutations, although it is still developing compared to DE. This thesis focuses on understanding and improving the function of an enzyme complex called Tryptophan Synthase (TrpS), composed of two parts: TrpA and TrpB. These two parts regulate each other through long-range interactions known as allosteric effects, which significantly influence their activity and flexibility. When separated, each part is less efficient, but together they adopt highly active forms. Understanding these communication pathways is key to designing improved enzymes that are efficient even on their own. Advanced computational techniques such as Molecular Dynamics (MD) simulations, Density Functional Theory (DFT) calculations, and correlation-based tools like Shortest Path Map (SPM) were used to reveal how TrpS subunits communicate and change shape during the reaction. In one part of the thesis, TrpA and its natural blueprint ZmBX1 were studied to identify key flexible regions important for enzyme activity. Through rational design involving specific mutations and structural modifications, TrpA variants with much higher efficiency and reduced dependence on TrpB were created. The thesis also explores how TrpB alone can retain high activity by analyzing its dynamic behavior and predicting important mutations using a combination of SPM, AlphaFold2 models, and different force field choices. This work demonstrates how computational approaches can successfully guide the design of enzymes with enhanced properties. Overall, this thesis shows how a deeper understanding of enzyme dynamics and allosteric regulation, combined with powerful computational tools, can lead to the rational design of more efficient enzymes, offering a strong alternative to traditional experimental methods

CAT- Els enzims són catalitzadors biològics extraordinaris que operen en condicions suaus amb una alta especificitat i eficiència. La millora del rendiment dels enzims sovint s'aconsegueix mitjançant mètodes experimentals com l'Evolució Dirigida (ED), que pot produir variants molt eficients, tot i això és un procés molt costós, lent i que sovint no proporciona una explicació del per què certes mutacions fan funcionar millor l’enzim en qüestió. El disseny computacional d'enzims està emergint com una alternativa potent, ja que ofereix la possibilitat de predir i racionalitzar els efectes de les mutacions, tot i que encara està en desenvolupament respecte a l’ED. Aquesta tesi es centra en entendre i millorar el funcionament d'un complex enzimàtic anomenat Triptòfan Sintasa (TrpS), compost per dues parts: TrpA i TrpB. Aquestes dues parts es regulen mútuament a través d'interaccions de llarga distància conegudes com a efectes al·lostèrics, que influeixen significativament en la seva activitat i flexibilitat. Quan les dues subunitats estan separades, cada part és menys eficient, però juntes adopten estructures altament actives. Comprendre aquestes rutes de comunicació és clau per dissenyar enzims millorats que siguin eficients de manera independent. Al llarg de la tesi, s'han utilitzat tècniques computacionals avançades, com ara simulacions de Dinàmica Molecular (MD), càlculs de Teoria del Funcional de la Densitat (DFT) i eines de correlació com el Shortest Path Map (SPM), per revelar com les subunitats de TrpS es comuniquen i canvien de forma durant la reacció. En una part de la tesi, s'han estudiat la TrpA i la ZmBX1 per identificar regions flexibles clau importants per a l'activitat enzimàtica. Mitjançant un disseny racional que inclou mutacions específiques i modificacions estructurals, s'han creat variants de TrpA amb una eficiència molt superior i una dependència reduïda envers la TrpB. La tesi també explora com la TrpB pot mantenir una alta activitat de manera independent, analitzant el seu comportament dinàmic i preveient mutacions importants mitjançant una combinació d'SPM, models d'AlphaFold2 i diferent eleccions de camps de força. Aquest treball demostra com els enfocaments computacionals poden guiar amb èxit el disseny d'enzims amb propietats millorades. En conjunt, aquesta tesi mostra com una comprensió més profunda de la dinàmica enzimàtica i la regulació al·lostèrica, combinada amb potents eines computacionals, pot conduir al disseny racional d'enzims més eficients, oferint una alternativa sòlida als mètodes experimentals tradicionals