El virus de la tristeza de los cítricos (CTV): desarrollo y aplicación de herramientas para establecer un sistema genético eficaz.

Abstract

Aunque en España los aislados más comunes de CTV son poco agresivos, en otros países suelen predominar aislados más virulentos que producen los síndromes de amarilleo (seedling yellows, SY) y acanaladuras en la madera (stem pitting, SP) en pomelo o naranjo dulce que conllevan a una disminución en la producción y calidad de los frutos. Por ello, el objetivo general de esta tesis ha sido el desarrollo de herramientas para controlar los aislados más virulentos de CTV. Para poner a punto un sistema genético eficaz que permitiera identificar los determinantes de patogenicidad de los síntomas de SY y SP se utilizó como base el aislado agresivo de origen español T318A (inductor de SY y SP), que ha sido caracterizado biológica y molecularmente. Una peculiaridad de este aislado es la presencia en su población de RNAs defectivos de gran tamaño que poseen capacidad de replicación autónoma que podrían servir como minireplicones naturales para el desarrollo de un sistema genético. Para poder evaluar la eficacia replicativa de los futuros clones de cDNA se desarrolló un protocolo de RT-PCR cuantitativa a tiempo real con SYBR Green que permite la detección y cuantificación de forma fiable de CTV en distintos tejidos y especies huésped y ha permitido identificar correctamente el 91% de los aislados como virulentos (inductores de SY, SP o ambos) o no virulentos por el valor de la temperatura de fusión (Tm) de sus productos de amplificación. A su vez, para identificar aislados potencialmente peligrosos en campo (inductores de SP en pomelo o naranjo dulce) se desarrolló un nuevo protocolo de RT-PCR a tiempo real con tres sondas Taqman tipo LNA, que permiten la detección y cuantificación de variantes de secuencia características de aislados no virulentos, virulentos inductores de SP y virulentos tipo T36 (inducen SY pero no SP). Este nuevo protocolo se aplicó al análisis de la población viral de plantas co-inoculadas con un aislado no virulento y otro inductor de SP para estudiar la capacidad invasiva y de acumulación de cada aislado. Por último, en el desarrollo de un sistema genético basado en T318A se ensayó en primer lugar su capacidad para replicarse en protoplastos de Nicotiana benthamiana. La construcción de un cDNA infeccioso del genoma completo de T318A se inició construyendo minireplicones basados en algunos de sus RNAs defectivos de gran tamaño, colocados bajo la acción del promotor 35S en un vector binario y con la pauta de la ORF 1a interrumpida por un intrón para reducir su toxicidad en bacterias. La agroinfiltración de estos clones dio lugar a una replicación eficiente en hojas de N. benthamiana y a partir de los minireplicones que más se acumulaban se obtuvieron clones de longitud completa insertándoles la región central del genoma que les faltaba. Aunque todos los clones de longitud completa se replicaron en hojas agroinfiltradas de N. benthamiana la pauta de acumulación del RNA genómico de T318A sugiere que este aislado no se mueve a células vecinas ni produce una infección sistémica.

The common CTV isolates in Spain are not very aggressive and they only produce decline of varieties grafted on sour orange, while in other countries more virulent isolates that produce the seedling yellows (SY) and stem pitting syndromes (SP) in grapefruit or sweet orange prevail with independence of the rootstock used. The general objective of this thesis was the development of tools to control the most virulent isolates of CTV. To accomplish this, the development of an effective genetic system that allow the characterization of the genetic determinants of the symptoms of SY and SP has begun. To set up an effective genetic system that permit the identification of the pathogenicity determinants of the symptoms of SY and SP the aggressive Spanish isolate T318A (inductor of SY and SP) was used, that was characterized biological and molecularly. A peculiarity of this isolate is the presence in its population of defective RNAs of high size that possess capacity of autonomous replication. To evaluate the replicative ability of the cDNA clones it was developed a real-time RT-PCR assay using SYBR Green for specific and reliable quantitative detection of CTV in different citrus species and tissues infected with pathogenically distinct CTV isolates sampled from plants growing in the greenhouse or in the field. Also, to identify isolates potentially dangerous in the field (able to induce SP in grapefruit or sweet orange trees) a new protocol of real time RT-PCR was developed with three Taqman LNA probes that allow the detection and quantification of characteristic sequence variants of each of the three main CTV groups observed, that include mild, severe SP, and T36-like isolates, respectively (SY but non SP). Finally, in the development of a genetic system based on T318A, the agroinfiltration of these clones provided an efficient replication in leaves of Nicotiana benthamiana although the accumulation of genomic RNA of T318A suggests that this isolate does not move to neighbouring cells neither it produces a systemic infection.