Estructura tridimensional del domini extracel·lular de 4F2hc (CD98) humà

Abstract

Els transportadors heteromèrics d'aminoàcids (HATs) estan formats per dues subunitats: una subunitat pesada (HSHAT) i una subunitat lleugera (LSHAT) unides per un pont disulfur. Mutacions en algun dels seus membres són responsables d'aminoacidúries hereditàries, com la lisinúria amb intolerància a proteïnes (LPI) o la cistinúria. Es coneixen dues HSHATs: 4F2hc i rBAT que són glicoproteïnes de membrana de tipus II amb un domini intracel·lular N-terminal, un domini transmembrana i un gran ectodomini C-terminal.<br/>Aquesta tesi recull els resultats obtinguts a partir de l'expressió en E. coli i la posterior purificació de l'ectodomini de 4F2hc (4F2hc-ED) humà. El principal resultat és la resolució de l'estructura tridimensional d'aquest domini de la proteïna mitjançant cristal·lització i difracció de raigs X. S'han resolt dos tipus de cristalls, un de monoclínic a 2,1 Å (amb una molècula en la unitat asimètrica) i un d'ortoròmbic a 2,8 Å (amb dues molècules en la unitat asimètrica coordinant un àtom de zinc). 4F2hc-ED té una estructura molt semblant a les &#945;-glucosidases de bacteris i consta d'un domini A, que és un barril (&#946;/&#945;)8 o barril TIM i un domini C, format per 8 fulles beta antiparal·leles. El treball presenta l'estructura de 4F2hc-ED i la compara amb les estructures conegudes de glucosidases de bacteris. També es presenta un model estructural per a rBAT, l'altra subunitat pesada dels transportadores heteromèrics d'aminoàcids. Però la producció i purificació d'aquesta proteïna ens ha permès realitzar, també, estudis de funció i interacció amb altres molècules. L'homologia amb les &#945;-glucosidases de bacteris ens han portat a provar activitats relacionades amb aquests enzims. En aquest sentit s'han usat substrats per determinar l'activitat &#945;-glucosidasa i s'han fet estudis d'interacció amb glúcids, sense èxit. L'estudi de l'estructura revela una superfície de càrregues polaritzada, amb una superfície carregada positivament al voltant de l'N-terminal (al voltant del coll que uneix l'ectodomini amb el domini transmembrana) que s'hipotetitza que interaccionaria amb els caps polars de la membrana cel·lular i ens dóna una idea de com podria aquesta proteïna interaccionar amb altres proteïnes com les LSHATs.<br/>Aquesta tesi aporta informació per a l'estudi estructura-funció d'aquests transportadors, però també per a l'estudi de les diferents funcions i processos en els quals 4F2hc ha estat vinculat en la literatura, com activació d'integrines i tumorigènesis. Finalment es discuteix sobre l'existència fisiològica del homodimer de l'ectodomini descobert en el cristall ortoròmbic i el paper de la coordinació de zinc.

<I>The heteromeric amino acid transporters (HATs) are composed by two subunits: a heavy subunit (HSHAT) and a light subunit (LSHAT) linked by a disulfur bridge. Mutations in some of their members are responsible for two aminoaciduries: lisinuric protein intolerance (LPI) and cystinuria. There are two described HSHATs, 4F2hc and rBAT and they are a type II membrane glycoprotein, with an intracellular domain N-terminal, a transmembrane domain and a bulky ectodomain C-terminal.<br/>This thesis gathers the results obtained from the expression in E. coli and subsequent purification of human 4F2hc ectodomain (4F2hc-ED). The main result is the resolution of the three-dimensional structure of this domain using crystallization and x-ray diffraction. We solved two structures from two different crystal forms: a monoclinical at 2.1 Å (with one molecule in the asymmetric unit) and an orthorhombic at 2.8 Å (with a homodimer in the asymmetric unit coordinating a zinc atom). The 4F2hc-ED structure is very similar to bacterial &#945;-glucosidases and is composed by two domains: a A domain with is a (&#946;/&#945;)8 barrel or TIM barrel architecture, and a C domain formed for eight antiparallel beta sheets. This work presents the structure of the 4F2hc ectodomain and compares it with known structures of bacterial &#945;-glucosidases. Furthermore, a 3D model for rBAT is shown and compared with 4F2hc-ED and &#945;-glucosidase structures. We tested the &#945;-glucosidase activity of the purified domain using &#945;-amylase substrates. Unfortunately, the results were negative in all cases. This thesis contributes in a better understanding of the structure-function relationships of the HATs, but also for the study of the different physiological implications of 4F2hc described in the literature, like integrin activation and tumorigenesis. Finally, the physiological existence of the homodimer of the ectodomain and the role of the zinc coordination, found in the orthorhombic crystal, is discussed. We suggest a model for interaction of 4F2hc-ED with cell membrane. </I>