Identificació de proteases mitjançant proteòmica basada en activitat.

Abstract

Actualment, les proteïnes implicades en la biosíntesi i la degradació dels neuropéptidos estan cobrant un gran interès com a possibles noves dianes terapèutiques ja que determinen els nivells de neuropèptid actiu i en controlen la seva acció. En casos de patologia, els nivells fisiològics de determinats neuropèptids poden veure's alterats i la modulació de l'actividad d'aquestes proteïnes permetria augmentar o disminuir els nivells dels neuropèptids fins a nivells normals i contrarrestar així les possibles alteracions patològiques. Conseqüentment, resulta evident que l'estudi i la identificació de noves proteïnes relacionades amb els processos de biosíntesis o d'inactivació dels neuropèptids és un camp d'investigació molt prometedor per a l'establiment de possibles noves dianes terapèutiques. I és en aquest context on s'emmarca aquesta tesi que té com a principals objectius establir una metodologia per a la identificació de proteases d'extracte de cervell mitjançant sondes basades en activitat, i utilitzar aquesta metologia per a la identificació de noves proteases implicades en el processament de neuropèptids.<br/><br/>Inicialment, per assolir el primer objectiu s'han dissenyat sondes basades en activitat de tipus fosfonat per tal de detectar una proteïna model a partir d'extractes de cervell mitjançant tècniques electroforètiques i de proteòmica. Els fosfonats reaccionen amb proteïnes serina proteasa amb les quals estableix enllaços covalents i irreversibles. La síntesi i utilització d'aquestes sondes ha permès aïllar i detectar específicament la proteïna model tant per marcatge directe en gels de fluorescència com per espectrometria de masses (MudPIT). La detecció selectiva de la proteïna model únicament quan s'utilitza una sonda basada en un substrat conegut ha permès validar el disseny metodològic i confirmar que la utilització de seqüències aminoacídiques en la regió espaiadora és fonamental per dirigir les sondes cap a les proteïnes que processen substrats similars. L'experiència adquirida en els assajos anteriors ha permès dissenyar unes noves sondes de tipus aldehid per incorporació d'un grup fotoreactiu que estableix un enllaç covalent i irreversible entre la proteïna d'interès i la sonda. D'aquesta manera, s'han desenvolupat sondes basades en activitat de tipus aldehid que, després de ser irradiades amb llum ultraviolada, s'uneixen de forma covalent i irreversible a les proteïnes d'interès. La utilització de sondes de tipus aldehid facilita l'exploració de les proteases d'interès amb independència de la seva classe enzimàtica, alhora que permeten modular-ne la selectivitat mitjançant les seqüències aminoacídiques. Aquestes sondes són lleugerament menys sensibles que les sondes de tipus fosfonat, però permeten la caracterització del proteoma mantenint les característiques dels aldehids com són l'àmplia reactivitat, la reducció de problemes estèrics i la facilitat de síntesi.<br/><br/>Per altra banda, s'ha procedit a assolir el segon objectiu principal de la tesi: l'exploració del proteoma de cervell i glàndula pituïtària mitjançant tècniques de proteòmica basada en activitat per a la identificació de noves proteases. Per assolir aquest objectiu, s'han dissenyat i sintetitzat noves sondes basades en activitat de tipus fosfonat per a l'exploració del proteoma. El disseny d'aquestes sondes s'ha realitzat a partir de la seqüència peptídica de diversos fragments de la cromogranina B descrits a la bibliografia i s'han sintetitzat les sondes Aha-Ala-LeuP(OR)2, Aha-Arg-LeuP(OR)2, Aha-Glu-LeuP(OR)2 i Aha-Asp-TrpP(OR)2 combinant estratègies de síntesi en solució i síntesi en fase sòlida. Aquestes sondes s'han utilitzat per a aïllar i identificar noves proteases a partir d'extractes de cervell i glàndula pituïtària tant per marcatge directe en gels de fluorescència i posterior escissió i anàlisi de les bandes d'interès com per tecnologia MudPIT. Aquestes tècniques han permès identificar algunes proteïnes candidates com el precursor de la carboxilesterasa de fetge, la proteïna de 83 kDa, el precursor de la serotransferrina i la proteïna Ndr2.

<I>Proteases involved in both neuropeptide biosynthesis and neuropeptide inactivation are getting increasing attention as an attractive target for drug discovery. In pathological situations neuropeptide physiological levels may be unbalanced and the modulation of the activity of the proteases involved in these processes may restore neuropeptide abundance to normal levels. In this context, the aim of the project was to use activity-based proteomics to isolate and identify new neuropeptide-processing proteases from neuroendocrine tissues.<br/><br/>First we establish a methodology by using dipepetidyl activity-based probes to label, purify and identify proteases from neuroendocrine tissues. As a first step some activity-based probes were synthesized using a dipeptidyl spacer that improves probe selectivity and a phophonate reactive group. The functional characterization of mouse brain proteome with a proline-derived dietoxiphosphonate probes allowed the specific and activity-dependent detection of a model serine protease by both in-gel analysis and mass spectrometry (MudPIT).<br/><br/>After the set up of the methodology, new dipeptidyl phosphonate probes were synthesized like Aha-Ala-LeuP(OR)2, Aha-Arg-LeuP(OR)2, Aha-Glu-LeuP(OR)2 and Aha-Asp-TrpP(OR)2 whose sequences were based on several chromogranin-derived peptides. The use of these probes in mouse brain and pituitary homogenates led to the identification of several proteins that may be involved in neuropeptide processing, like the Liver carboxylesterase N precursor, the 83Kda protein, the Serotransferrin precursor and the Ndr2 protein. </I>