New Orthogonal Strategies for Peptide Synthesis

Abstract

Synthesis of Cys-containing peptides has long been posed as an attractive challenge for peptide chemist. Protecting groups for the nucleophilic beta-thiol group of Cys residues must be stable during peptide elongation, and can be removed under mild conditions when necessary. Synthesis of peptides with multiple-disulfide bonds frequently demands the implementation of additional orthogonal dimensions into the protection schemes. Therefore, combinations of orthogonal and/or compatible protecting groups for each pair of Cys residues enable the regioselective formation of disulfide bridges. The development and study of novel protecting groups for the side-chain of the Cys residue may increase the number of synthetic tools for the efficient synthesis of Cys-containing peptides. The solid-phase strategy has been applied for the preparation of small, medium-sized peptides. Nevertheless, the elongation of large peptide sequences through a stepwise solid-phase peptide synthesis is limited and convergent strategies, such as fragment condensation approach should be adopted. The preparation of fully protected peptide fragments on solid phase for convergent synthesis calls for handles with maintain intact the side-chain protecting groups upon cleavage. The present thesis has focused on the development and application of novel orthogonal strategies for the synthesis of complex peptides, including Cys-containing peptides and long and difficult peptide sequences by fragment condensation approach. Specifically, different Cys-protecting groups have been evaluated and a handle has been designed and developed.

Recientemente, el péptido linaclotide ha sido aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) y por la European Medicines Agency (EMA) para el tratamiento de enfermedades gastrointestinales tales como el estreñimiento crónico (EC) y el síndrome del intestino irritable (SII)1. Linaclotide es administrado oralmente, y es un potente agonista selectivo del receptor de la guanilato ciclasa tipo C (GC-C) localizado en el intestino.

Desde un punto de vista estructural, este péptido de cadena corta presenta un elevado número de residuos de cisteínas que le confieren una conformación bien definida debido a la presencia de tres enlaces disulfuro intramoleculares entre los residuos Cys1-Cys6, Cys2-Cys10 y Cys5-Cys13.

El diseño y la optimización de una estrategia sintética eficiente para la obtención de cantidades que permitan satisfacer el mercado en un futuro, se presenta como un reto debido a la presencia de sus tres puentes disulfuro. Para la optimización de dicha síntesis es fundamental establecer y discutir sus dos principales limitaciones: el riesgo de racemización de los residuos de cisteína durante la síntesis lineal de la cadena peptídica; y el posterior plegamiento y formación de los enlaces disulfuros correctamente.

Se diseñaron y estudiaron diversas estrategias regioselectiva, semi-regioselectiva y se exploró la posibilidad de preparar el péptido linaclotide siguiendo una estrategia aleatoria, utilizando un esquema de protección de los residuos de cisteína no selectivo. La elección de los grupos protectores del grupo tiol de las cisteínas, su posición en la secuencia, la influencia de los grupos protectores vecinos, además del orden de plegamiento y formación de los enlaces disulfuro fueron objeto de estudio.

Finalmente, el péptido completamente plegado y oxidado se analizó detenidamente con el fin de confirmar que la conectividad establecida entre los residuos de cisteína coincidían con los enlaces disulfuro nativos presentes en Linaclotide.