Metabolisme lipídic en plantes: Caracterització de la dehidrodoliquildifosfat sintasa 1 i de les proteïnes Arv d'

Abstract

Els dolicols i poliprenols són alcohols polisoprenoides de cadena llarga implicats en processos com la síntesi de la paret cel.lular i la glicosilació de proteïnes. El primer pas específic de la seva via de síntesi és la addició seqüencial de IPP sobre el FPP per donar lloc al dehidrodolicol en una reacció catalizada per les cis-preniltransferases, anomenades dehidrodolicoldifosfat sintases. A pesar de la seva importància, la biosíntesi d'aquests compostos està molt poc estudiada, en especial en plantes. A partir d'una seqüència genòmica identificada prèviament en el genoma d'<i>A. thaliana</i> amb capacitat per codificar una dehidrodolicoldifosfat sintasa, s'ha clonal l'ADNc de la dehidrodoliquildifosfato sintasa 1 (AtDps1p) de <i>A. thaliana</i>. S'ha demostrat que la proteïna AtDps1p és una dehidrodolicol-PP sintasa funcional, ja que complementa el fenotip de termosensibilitat de la soca de llevat SNH23-7D mutant pel gen RER2, que codifica per una dehidrodolicol-PP sintasa, i restaura la síntesi de dolicols en aquesta soca. Mitjançant la generació de proteïnes de fusió amb la GFP i la seva expressió transitòria en cèl.lules epidèrmiques de ceba hem vist que la AtDps1p es localitza en el RE gracies al seu extrem N-terminal hidrofòbic, el qual és essencial per la funcionalitat de la proteïna. Mitjançant un anàlisi de Northern blot en diferents teixits d' <i>A. thaliana</i> hem demostrat que el gen s'expressa de forma feble en tos el teixits, excepte en les arrels on s'expressa intensament. La disponibilitat del genoma sencer d'<i>A. thaliana</i> ens ha permès identificar en el genoma de <i>A. thaliana</i> 8 genes addicionals amb capacitat per a codificar cis-preniltransferases.<br/><br/>En els últims anys s'ha posat de manifiest l'existència d'una regulació coordinada del metabolisme de diferents espècies lipídiques, en especial del metabolisme d'esterols i esfingolípids. Encara que es desconeixen els mecanismes implicats en aquesta regulació, s'ha proposat que la proteïna Arv1 de llevat podria participar en aquest procés. Aquesta proteïna es localitza en el RE i l'aparell de Golgi i conté el domini AHD en el seu extrem aminoterminal, que inclou un possible dit de zinc. En aquesta Tesi s'han identificat dos genes (AtARV1 (At4g01510) y AtARV2 (At1g01020)) que codifiquen per a proteïnes Arv en A. thaliana. Mitjançant experiments de Northern blot, RT-PCR i la generació de plantes transgèniques que contenen una fusió traduccional dels promotors dels gens AtARV1 i AtARV2 s'ha observat que aquests gens s'expressen en teixitss que presenten una divisió i/o expansió cel.lular activa, i un metabolisme lipídic actiu. S'ha demostrat que ambdues proteïnes són funcionals mitjançant un assaig de complementació funcional de la soca de llevat YJN1756 mutant pel gen ARV1 i l'anàlisi del seu perfil lipídic Mitjançant la generació de proteïnes de fusió amb la GFP i la seva expressió transitòria en cèl.lules epidèrmiques de ceba hem vist que la AtArv1p i l AtArv2p es localitzen en el RE, peròque aquesta localització no és deguda al domini AHD. També s'ha demostrat que el subdomini C-terminal del domini AHD és essencial per a la funcionalitat de les proteïnes Arv. Finalment, s'ha vist que la inhibició de la síntesi d'esfingolípids amb miriocina i fumonisina afecta el flux de la via de síntesi d'esterols indirectament a través d'algún mecanisme post-traduccional en que estaria implicada la HMGR.

<I>Lipidic metabolism in plants: Characterization of A. thaliana's dehidrodoliquil-PP synthase and Arv proteins</i> <br/><br/>Dolichols and poliprenols are long chain polyisoprenoid alcohols implicated in processes such as cell wall biosynthesis and protein glucosylation. The first commited step of its biosynthesis is the condensation of multiple IPP units over the FPP to synthesize dehidrodoliquil-PP in a chemical reaction catalized by cis-prenyltransferases. Despite its importance, the biosynthetic pathway and its regulation are still very poorly understood, specially in plants. Here, we have cloned the cDNA of Arabidopsis thaliana's dehidrodoliquil-PP synthase (AtDps1p), and we have shown that it's a functional cis-prenyltransferase, that localizes in the ER thanks to an hidrofobic N-terminal domain. This hidrofobic N-terminal domain is essencial for the biological functionality of the protein. We have also shown that AtARV1 gene is expressed in all the tissues in a very low level, with the exception of the roots where it's higly expressed. Finally, we have localized in Arabidopsis thaliana's genome 8 addicional genes that can codify for cys-prenyltransferases.<br/><br/>During the last few years, a coordinated regulation of the metabolism of various lipids species, specially sterols and sphingolipids, have been shown. Although the molecular mechanisms of this coordinated regulation are currently unkonwn, it has been proposed that yeast's Arv1p protein can regulate the sterols intracelular distribution and upatke, and that it could play a role in the regulation of sterols and/or sphingolid metabolism. We have identified two genes (AtARV1 (At4g01510) and AtARV2 (At1g01020)) that codify for Arv proteins in Arabidopsis thaliana. Both genes are actively expressed in tissues with an active cell division and/or expansión, as well as in tissues with an active lipid metabolism. Both proteins are functional Arv proteins and localize in the ER. We have shown that the C-terminal subdomain of the AHD (Arv Homology Domain; that it's localized in the N-terminal end of Arv proteins) is essencial for the biological function of Arv proteins. Finally, we have also shown that the inhibition of the sphingolipid biosynthetic pathway, results in an indirect modification of the sterol biosynthetic pathway flow through a post-traduccional mechanism, involving at least the HMGR.