Estudi de l'especialització funcional dels isoenzims citosòlics de la farnesildifosfat sintasa d'Arabidopsis thaliana

Abstract

Les farnesildifosfat sintases (FPS) catalitzen la condensació de dues molècules d'isopentenildifosfat (IPP) amb una molècula de dimetilal.lildifosfat (DMAPP) per produir farnesildifosfat (FPP; C15). Tant els substrats com el producte de la reacció catalitzada per les FPS ocupen una posició molt important en la via del mevalonat de síntesi d'isoprenoides, ja que són punt de partida de nombroses ramificacions cap a la síntesi de diversos productes finals. A <i>Arabidopsis thaliana</i> existeix una petita família multigènica integrada pels gens <i>FPS1</i> i <i>FPS2</i>, que codifiquen tres isoenzims FPS: FPS1S, FPS1L i FPS2. L'isoenzim FPS1L conté un pèptid de trànsit que li confereix una localització mitocondrial, mentre que FPS1S i previsiblement FPS2, tenen una localització citosòlica. A l'inici d'aquest treball, s'havien clonat els gens <i>FPS1</i> i <i>FPS2</i>, i s'havien definit els seus patrons d'expressió espaial i temporal mitjançant l'anàlisi de plantes transgèniques portadores de gens quimèrics formats pels promotors d'ambdós gens fusionats al gen reporter <i>uidA</i> d'<i>E. Coli</i>. També s'havia estudiat el paper dels isoenzims FPS1S i FPS1L en la via del mevalonat a través de la caracterització de plantes transgèniques que sobreexpressaven aquests isoenzims. La localització de l'isoenzim FPS1L a les mitocòndries ja és, en sí mateixa, una evidència d'especialització funcional. En el cas dels isoenzims FPS1S i FPS2, el fet de pensar en l'existència d'una especialització funcional deriva dels seus patrons d'expressió diferencials.<br/>Amb l'objectiu d'analitzar el paper de l'isoenzim FPS2 en la via del mevalonat, i obtenir evidències de l'especialització funcional dels isoenzims FPS1S i FPS2, en aquesta tesi es duen a terme diferents abordatges experimentals basats en l'obtenció i caracterització de mutants d'<i>A. Thaliana</i> amb guany i pèrdua de funció dels gens <i>FPS1</i> i <i>FPS2</i>. Per una banda, mitjançant l'estudi dels efectes de la sobreexpressió de l'isoenzim FPS2 i de la sobreexpressió simultània dels isoenzims FPS1S i FPS2. D'altra banda, a través de l'anàlisi de mutants amb pèrdua de funció dels gens <i>FPS1</i> i <i>FPS2</i> i del doble mutant <i>fps1:fps2</i>. Aquests abordatges es complementen amb l'estudi dels efectes de la sobreexpressió en <i>A. Thaliana</i> de proteïnes quimèriques FPS1S/FPS2 (<i>domain swapping</i>), l'elaboració de models estructurals tridimensionals dels isoenzims FPS1S i FPS2 i l'anàlisi dels perfils d'expressió gènica en mutants amb pèrdua de funció dels isoenzims FPS.<br/>En aquest treball es demostra que els isoenzims FPS1S i FPS2, tot i catalitzar la síntesi del mateix producte, tenir la mateixa localització subcel.lular i uns paràmetres cinètics similars, produeixen efectes molt diferents quan són sobreexpressats en A. thaliana. La presència d'un únic isoenzim FPS és suficient per garantir la viabilitat de les plantes, ara bé, la pèrdua de funció de l'isoenzim FPS2 desencadena una resposta metabòlica compensatòria a les llavors. En conjunt, tots els resultats indiquen que els isoenzims citosòlics FPS1S i FPS2 desenvolupen funcions majoritàriament redundants, tot i que presenten una certa especialització funcional que sembla derivar del patró d'expressió especialitzat de cadascun dels gens <i>FPS</i>.

Farnesyldiphosphate synthases (FPS) catalyze the condensation of two molecules of isopentenyldiphosphate (IPP) with its isomer dimethylallyldiphosphate (DMAPP) to produce farnesyldiphosphate (FPP; C15). FPS is located at a key position in the mevalonic acid pathway (MVA), as both the substrates and the reaction product are precursors of a variety of isoprenoid end-products. <i>Arabidopsis thaliana</i> contains a small FPS gene family consisting of two genes, <i>FPS1</i> and <i>FPS2</i>, encoding three FPS isoforms: FPS1S, FPS1L and FPS2. FPS1L isoform is located in the mitochondria, whereas FPS1S and likely FPS2, are both localized in the cytosol. The differential patterns of expression of <i>FPS1</i> and <i>FPS2</i>, strongly suggest a functional specialization of the encoded FPS1S and FPS2 isoforms.<br/>The aim of this thesis is to analyze the role of FPS2 isozyme in the MVA pathway and to obtain evidence of a functional specialization of FPS1S and FPS2 isozymes. Different experimental approaches have been undertaken using <i>A. thaliana</i> mutants with gain and loss of function of FPS1S and FPS2. We have investigated the effects of FPS2 overexpression and the effects of the overexpression of both FPS isozymes simultaneously. We have also characterized <i>A. thaliana</i> knock-out mutants in both FPS genes and the double knock-out mutant <i>fps1:fps2</i>. Analysis of the effects caused by the overexpression of chimeric FPS1S/FPS2 proteins in <i>A. thaliana</i>, 3D modelling of FPS isozymes, and microarray analysis of FPS knock-out mutants are also included in this study.<br/>Results demonstrate that, although FPS1S and FPS2 isozymes synthesize the same reaction product, have the same subcellular localization and have similar kinetic parameters, its overexpression produce different effects in <i>A. thaliana</i>. The existence of a single FPS isozyme is enough to assure plant viability. However, FPS2 loss of function triggers a compensatory metabolic response in <i>A. thaliana</i> seeds. All these results indicate that FPS1S and FPS2 play redundant functions in the MVA pathway, although they also show a certain level of functional specialization.