Caracterització genètica i funcional de l'operó

Abstract

Fins el present treball es creia que el sistema <i>glc</i> estava implicat únicament en la capacitat de creixement a expenses de glicolat com a font externa de carboni i energia. S'ha pogut comprovar, però, que aquest juga un paper molt important en el control de la concentració del metabolit intermediari glioxilat. En el locus <i>glc</i>, situat al minut 64.5 del cromosoma d'<I>Escherichia coli</I>, s'han localitzat i seqüenciat un total de sis gens. Entre ells es troben els que codifiquen les subunitats de la glicolat oxidasa (<I>glcD, glcE, glcF</I>), l'activador transcripcional dels gens estructurals del sistema (<I>glcC</I>), una proteïna de funció encara per determinar (<I>glcG</I>) i el possible gen del transport del glicolat (<I>glcT</I>).<br/><br/>La glicolat oxidasa (enzim localitzat a la membrana citoplasmàtica que catalitza l'oxidació de glicolat per formar glioxilat) ha resultat ser un enzim heteroligomèric, format per tres subunitats catalítiques: dues subunitats (els productes gènics de <I>glcD</I> i <I>glcE</I>) semblen formar el nucli catalític de l'enzim, mentre que la tercera (producte gènic de <I>glcF</I>) sembla ser una subunitat ferrosulfürada a la qual es transfereixen els electrons provinents de l'oxidació de glicolat a glioxilat. La possible implicació del producte gènic de <I>glcG</I> en l'anclatge de les subunitats catalítiques a k membrana citoplasmàtica i el paper del producte gènic de <I>glcT</I> en el transport de glicolat i altres molècules estructuralment relacionades no han pogut ser definitivament determinades.<br/><br/>Els gens del locus <I>glc</I> estan organitzats en una unitat transcripcional que engloba tots els gens estructurals (<I>glcDEFGBT</I>) i que es troba sota el control del producte gènic de <I>glc</I> (GlcC), que es transcriu divergentment als gens estructurals i comparteix amb ells zona promotora. Els gens estructurals del locus glc tenen una estructura gènica d'opero: existeix un únic promotor funcional situat en posició 5' del gen <I>glcD</I> que regula l'expressió simultània de tots ells (<I>glcDEFGBT</I>). L'expressió dels gens estructurals és totalment dependent del regulador específic del sistema, GlcC, que és una proteïna amb funció dual: és activador transcripcional de <I>glcDEFGBT</I> i repressor de <I>glcC</I>.<br/><br/>L'expressió del promotor de <I>glcDEFGBT</I> és induïble per diferents fonts de carboni, principalment glicolat i en menor grau glioxilat (<i>per se</i> o per la formació intracel.lular de glicolat en una reacció de reducció catalitzada per l'enzim constitutiu glioxilat reductasa). Altres molècules estructuralment relacionades amb el glicolat (p.e. D-lactat, glicerat, acetat) són capaces d'induir l'expressió de l'operó <i>glc</i>. En creixements en glucosa l'operó <i>glc</i> està reprimit, tot i que la seva expressió no és nul.la. La repressió exercida en creixements en glucosa no és reversible per l'addició d'AMP cíclic (cAMP) al medi de cultiu, indicant que aquesta no està mediada pel complex CRP-cAMP (Catabolite Repressor Protein).<br/><br/>S'ha demostrat que existeixen diferents factors de transcripció globals que regulen l'expressió dels gens estructurals del sistema <i>glc</i>. D'una banda, s'ha pogut comprovar que l'expressió de <i>glcDEFGBT</i> és totalment dependent del factor de transcripció IHF (Integration Host Factor). Tant experiments <i>in vivo</i> com <i>in vitro</i> han mostrat la completa dependència en IHF per la formació del correcte complexe nucleoproteic capaç d'iniciar la transcripció, i l'anàlisi <i>in silico</i> de la seqüència del promotor ha permès identificar possibles seqüències consens d'unió d'IHF. D'altra banda, s'ha demostrat que la repressió anaeròbica del locus <i>glc</i> està mediada a nivell transcripcional pel sistema de dos components ArcB/ArcA. En el promotor de <i>glcDEFGBT</i> s'han pogut localitzar les seqüències consens d'unió del regulador transcripcional ArcA. En relació a l'estudi de la unió d'ArcA als seus promotors diana, s'han dut a terme experiments de mutagènesi dirigida de la seqüència consens per ArcA del promotor d'un altre gen relacionat amb el sistema <i>glc</i>: el gen <i>aldA</i>. El promotor d'aquest gen mostra una seqüència conservada 10/10 respecte al consens per ArcA. S'ha pogut demostrar, tant <i>in vivo</i> com <i>in Vitro</i>, la validesa d'aquest consens, que havia estat proposat i establert anteriorment en base a estudis <i>in vitro</i> de diferents sistemes diana d'ArcA.<br/><br/>Existeix una inducció creuada entre els sistemes <i>glc</i> i <i>ace</i> (que codifica els enzims del cicle del glioxilat, entre ells la malat sintasa A, isoenzim de malat sintasa G, necessaris pel creixement d'<i>Escherichia coli</i> en acetat). Sobre tots dos sistemes, els factors IHF i ArcA exerceixen una regukció del mateix signe. El sistema <i>glc</i> està induït en creixements en acetat i s'ha comprovat per l'anàlisi de mutants dels dos sistemes que cadascuna de les dues malat sintases pot suplir la funció de l'altra.<br/><br/>El fet que els enzims glicolat oxidasa i malat sintasa G es sintetitzin conjuntament, l'observació que la seva expressió mai no és completament nul·la i que mutants glicokt oxidasa (que són incapaços de transformar glicolat en glioxilat) sobreexpressen el sistema, pot respondre a un mecanisme de seguretat enfront k toxicitat del glioxilat. Quan es sintetitza glicolat oxidasa es sintetitza malat sintasa G, la qual cosa assegura l'eliminació de I'aldehid tòxic per formació de malat. El glioxilat es forma a nivell intracel.lular per oxidació de glicolat, degradació de purines, creixements en acetat i en hidrolitzat de caseina. Aquest serà ràpidament metabolitzat per acció de la glioxilat reductasa, dels enzims de la via del D-glicerat, per la malat sintasa G i per la malat sintasa A. <br/><br/>Per tant, la importància del sistema <i>glc</i> va més enllà de la capacitat de creixement en presència de glicolat i es situa a nivell de les modulacions en les concentracions de l'intermediari metabòlic glioxilat, ja que codifica enzims que intervenen en la seva formación (glicolat oxidasa) i en el seu metabolisme (malat sintasa G).