Estudi de les funcions nuclears d'IKKAalpha en el càncer colorectal

Abstract

Les cèl·lules de càncer colorectal adquireixen el fenotip tumoral mitjançant l'acumulació de mutacions en gens específics. Les mutacions més prevalents en el càncer de còlon es produeixen en el gen APC i indueixen l'acumulació de beta-catenina nuclear. Però la transcripció depenent de beta-catenina no és l'únic requeriment per la progressió del càncer colorectal ja que la inhibició de l'activitat gamma-secretasa redueix la tumorigènesi en ratolins APCmin/+. En canvi, l'activació de Notch a l'intestí resulta en un bloqueig de la diferenciació de cèl·lules secretores i una expansió dels progenitors immadurs.<br/>A més dels factors de transcripció, existeixen complexes multiproteics, que inclouen corepressors nuclears (NCoRs), com N-CoR i SMRT, i deacetilases d'histones (HDAC) responsables dels silenciament específic de grups de gens, mitjançant el qual regulen processos cel·lulars molt important com són la diferenciació cel·lular, el desenvolupament embrionari i l'homeòstasi tissular.<br/>La via de transducció de la senyal d'NFkappaB està implicada en la resposta immune i inflamatòria així com en el desenvolupament de tumors de mama, fetge, i intestí. Aquesta via s'activa, en resposta a estímuls, a través del complex IKK, que fosforila el repressor d'NFkappaB, IkappaB, induint la seva degradació pel proteosoma, la translocació a nucli d'NFkappaB i l'activació del programa gènic corresponent.<br/>Recentment s'han identificat altres funcions per a les proteïnes IKKs, diferents a les anteriorment descrites. Algunes d'aquestes funcions tenen lloc a nivell de la cromatina i inclouen, entre d'altres, la fosforilació de la H3 y la fosforilació del repressor nuclear SMRT.<br/>Treballs previs del nostre laboratori demostren que tant la IKKalpha com la IKKbeta és recluten al promotor de hes1 i herp2 en resposta a l'activació per TNFalpha. Aquest reclutament coincideix amb l'alliberament de complexes repressors formats per IkappaBalpha y HDACs, així com amb l'activació transcripcionals d'aquests gens.<br/>L'objectiu principal de la meva tesi ha estat determinar si les IKK juguen algun paper en la regulació dels gens diana de Notch en les cèl·lules de càncer colorectal, i si aquest és el cas, determinar quins són els mecanismes d'activació de les IKK en aquestes cèl·lules i les seves implicacions en el desenvolupament del procés tumoral. Els nostres resultats demostren que les cèl·lules de càncer de còlon presenten una activació anòmala d'IKKalpha a nivell nuclear fosforila al repressor transcripcional SMRT. Hem descrit que en aquestes cèl·lules, la IKK es troba associada de forma específica als promotors de gens de la família de Notch tals com hes1, herp2 i hes5, coincidint amb l'alliberament del repressor SMRT d'aquest promotors i amb la seva activació transcripcional. La inhibició de l'activitat IKK restableix l'associació d'SMRT als promotors reprimint la seva activació. Això és concomitant amb una disminució de la proliferació i un increment de l'apoptosi en les cèl·lules de càncer de còlon. El tractament amb inhibidors de la IKK disminueix el creixement de tumors implantats en ratolins immunodeprimits. A més, també hem demostrat que l'activitat IKKalpha nuclear de les cèl·lules de càncer de còlon també fosforila el repressor N-CoR, un homòleg d'SMRT, induint el seu export al citoplasma cel·lular.<br/>Actualment, el projecte està focalitzat en determinar els mecanismes que indueixen l'activació de la IKKalpha en el càncer colorectal. Els resultats més recents indiquen que en les cèl·lules de càncer de còlon podria haver una forma truncada de la proteïna, que no té els dominis necessaris pel seu manteniment a citoplasma però que conserva el domini quinasa intacte. Els nostres esforços es centren en caracteritzar bioquímicament aquesta forma així com en determinar la seva funció pro-tumorogènica. Tenim alguns resultats preliminars que suggereixen que la forma truncada de la IKKalpha podria ser el resultat de la degradació parcial pel proteosoma, dependent d'ubiqüitinació, de la IKKalpha sencera (FL-IKKalpha). Les dades que tenim suggereixen que les característiques bioquímiques d'aquesta forma truncada d'IKKalpha difereixen de les de la FL-IKKalpha, i que això determina que les seves funcions siguin també diferents. En aquest sentit, creiem que mentre FL-IKKalpha és qui forma part del complex de quinases reguladores de la via NFkappaB, la IKKalpha truncada podria ser la responsable de la fosforilació de repressors nuclears. Més important encara, creiem que aquesta forma truncada coopera amb K-Ras més eficientment que la forma sencera en la generació de focus de transformació en cèl·lules NIH-3T3, suggerint que la forma truncada de la IKKalpha té potencial tumorigènic.

<i>Colorectal cancer cells accumulate multiple mutations in specific sets of genes. Mutation of adenomatous polyposis coli (APC) that leads to the accumulation of nuclear beta-catenin, is the most prevalent event in these multistep process. However, not only beta-catenindependent transcription is required for colorectal cancer progression, because abrogation of the Notch pathway prevents tumorigenesis in APCmin/+ mice whereas activation of Notch results in the expansion of the progenitor compartment in the intestine.<br/><br/>NFkappaB signalling pathway is involved in inflammatory and immune response as well as in tumour development in breast, liver and intestine. The NFkappaB signalling pathway is activated in response to different stimuli that induce the activation of the IKK complex, that phosphoylates the NFkappaB inhibitor, IkappaBalpha permitting the NFkappaB-dependent transcription.<br/>Recently, chromatin associated functions for IKK have been described, resulting in the transcriptional activation of NFkappaB dependent and independent genes.<br/><br/>We have described that colorectal tumour cells have and aberrant nuclear IKKalpha activity that phosphorylates Nuclear Co-repressors (NCoRs), inducing its cytoplasmic export and the derepression of different genes, among them the Notch target genes: hes1, herp2 and hes5, that are related with the maintenance of the undifferentiated phenotype of intestinal cells.<br/><br/>In addition, we have demonstrated that IKK activity restores the normal expression of these Notch target genes and decrease the proliferation of tumour cells "in vitro" and "in vivo". However, the IKK inhibitors can not be used as therapeutically agents due to their toxicity derived from the total inhibition of NFkappaB signalling. For this reason is crucial to define the tumorigenic properties of IKK proteins, in order to specifically inhibit them, without affecting the IKK physiological role.<br/><br/>Nowadays, the project is focused in determining how the IKKalpha is activated in colorectal cancer. Our preliminary results suggest that colorectal cancer cells contain a truncated form of IKKalpha that when becomes activated preferentially localizes in the nucleus and differs from the full-length form in several biochemical and functional properties. This truncated IKKalpha does not participate in the activation of NFkappaB but displays specific activities that have been associated with cancer such as phosphorylation of the nuclear co-repressors. Moreover, expression of the truncated IKKalpha, but not the full-length IKKalpha, increases the transformation capacity of k-ras in NIH-3T3, suggesting a tumorigenic potential for this IKKalpha isoform. </i>