Paper de la unió del plasminogen a la alfa-enolasa durant la miogènesi

Abstract

El sistema d'activació del plasminogen (PA) és un grup de serina-proteases que participen en nombrosos processos en els quals té lloc de degradació de la matriu extracel·lular (ECM). El plasminogen, mitjançant l'acció dels seus activadors específics, dóna lloc a la plasmina activa. La plasmina és una potent proteasa d'ampli espectre de substrat. El seu paper clàssic ha estat la degradació dels coàguls de fibrina, tot i que també actua sobre altres components de l'ECM directament, i de manera indirecta mitjançant l'activació de diverses metal·loproteases. Tanmateix, la plasmina pot activar les formes latents de diversos factors de creixement. Aquest potent sistema de proteases està regulat a diferents nivells: a nivell d'inhibidors i a nivell de receptors que concentren l'activitat proteolítica a l'espai pericel·lular. Existeixen diverses proteïnes situades a la membrana cel·lular que posseeixen l'habilitat d'unir plasminogen, entre elles cal destacar l'alfa-enolasa. L'alfa-enolasa és un enzim glucolític que es transloca a la membrana cel·lular mitjançant un mecanisme desconegut, on actua com a receptor del plasminogen. La unió del plasminogen als seus receptors facilita la seva activació a plasmina i la protegeix de l'acció dels seus inhibidors.<br/><br/>El sistema PA participa en un elevat nombre de processos fisiopatològics que requereixen un elevat grau de proteòlisi. Entre aquests processos cal destacar la remodelació tissular i, en particular, la remodelació del múscul esquelètic. El teixit muscular és un bon exemple de proteòlisi extracel·lular massiva després d'un miotraumatisme. Resultats previs demostraren que l'activador del plasminogen de tipus urokinasa (uPA) i el plasminogen desenvolupen un paper fonamental durant el procés de regeneració muscular. El principal objectiu d'aquesta tesi fou l'anàlisi del paper de la unió plasminogen/alfa-enolasa durant la miogènesi in vitro i la regeneració muscular in vivo. Aquest treball es va dur a terme mitjançant l'ús d'inhibidors de la unió plasminogen/alfa-enolasa (MAb 11G1, contra l'alfa-enolasa; i EACA, contra el plasminogen) i l'ús d'un inhibidor de l'activitat proteolítica de la plasmina lliure (aprotinina) en models de miogènesi in vitro i regeneració muscular in vivo. El cultiu de mioblasts murins primaris en presència dels tres inhibidors va demostrar una inhibició sobre la diferenciació de l'ordre d'un 50% després del tractament amb MAb 11G1 i EACA, mentre que l'aprotinina no tingué cap efecte. En canvi, quan s'analitzava el procés de fusió, la inhibició fou del 90%. Aquest resultat indica que, després del bloqueig de la unió del plasminogen al seu receptor, els mioblasts inicien el procés de diferenciació, però no arriben a fusionar-se en cap moment, demostrant que la unió del plasminogen a l'alfa-enolasa és un mecanisme clau durant la miogènesi. <br/>A continuació es va analitzar el paper de la unió plasminogen/alfa-enolasa durant la regeneració del múscul esquelètic in vivo, mitjançant l'ús de dos models animals: un model de regeneració muscular mitjançant una injecció amb cardiotoxina (CTX) i el ratolí distròfic mdx, el model animals per a la Distròfia Muscular de Duchenne (DMD). Els resultats obtinguts mostraren que els inhibidors de la unió plasminogen/alfa-enolasa bloquegen el procés de regeneració muscular després d'una lesió amb CTX, mentre que l'aprotinina no té cap efecte, mostrant que l'activitat proteolítica de la plasmina unida a la membrana cel·lular és necessària durant la regeneració muscular. <br/>Quan s'analitzà l'efecte dels diferents inhibidors en els ratolins distròfics mdx la patologia esdevingué més severa, indicant que el bloqueig de la unió del plasminogen al seu receptor provoca un important agreujament en la distròfia dels ratolins mdx. <br/>Tots aquests resultats demostren que l'activitat proteolítica de la plasmina associada a l'alfa-enolasa desenvolupa un paper fonamental en el procés de regeneració muscular in vivo, mentre que l'activitat proteolítica de la plasmina lliure no participa en aquest procés.

<i>Plasminogen Activation (PA) System is a group of serin-proteases that participates in biological processes in which extracellular matrix (ECM) remodeling takes place. Plasmin, generated by plasminogen activation, is an extracellular protease specialized in the degradation of the ECM components. Several proteins able to bind plasmin(ogen) to the cell surface have been described. In particular, alpha-enolase acts as a plasmin(ogen) receptor in several cell types concentrating proteolytic activity on the cell surface. PA system participates in a high number of biological processes, including skeletal muscle remodelling. Previous results showed an overexpression of alpha-enolase during myoblasts differentiation in vitro, and in skeletal muscle regeneration in vivo, suggesting an important role of this protein during these processes. So, the main goal of this work was the analysis of the role of plasmin(ogen)/alpha-enolase binding during myogenesis and skeletal muscle regeneration. <br/><br/>For this goal, we used inhibitors of plasminogen/alpha-enolase binding: MAb 11G1 and EACA. Using primary cultures or Muscle Precursor Cells (MPCs), our results showed that myogenic differentiation, fusion and cell migration were abrograted in the presence of inhibitors of plasmin(ogen)/alpha-enolase binding. The effect of plasmin(ogen)/alpha-enolase binding inhibitors were evaluated in a regeneration model in mice after an injury. Muscle regeneration was blocked by plasmin(ogen)/alpha-enolase binding inhibitors, as assessed by histological and morphological parameters. When the mdx mice (the animal model for Duchenne Muscular Dystrophy, DMD) were treated with plasminogen/alpha-enolase binding inhibitors the myopathology became more severe. <br/>Our results demonstrate that plasmin(ogen)/alpha-enolase association is necessary for myogenesis and muscle regeneration to take place correctly.</i>