Virulence of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis and activity of drug combinations against drug-resistant and drug-susceptible isolates in ex-vivo and in vitro models

Abstract

Tuberculosis (TB) remains a global threat worldwide with nearly nine million incident cases of TB. The emergence of M. tuberculosis resistance to antituberculous drugs has led to the need for careful TB surveillance and control. Further knowledge of drug-resistant M. tuberculosis plays an important role in avoiding TB transmission as well as designing more efficient schedules of treatment.

The objectives were: 1) to analyse of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis resistant to antituberculous drugs to penetrate and grow within murine macrophages compared with drug-susceptible isolates; 2) to determine the in vitro synergistic activity of the following combinations against clinical isolates of M. tuberculosis resistant to isoniazid (INH) compared with drug-susceptible isolates: a) INH-rifampicin (RIF)-ethambutol (EMB), b) ofloxacin (OFL)-RIF-EMB; 3) to determine the in vitro synergistic activity of the following combinations against clinical isolates of multi-drug resistant M. tuberculosis compared with drug-susceptible isolates: a) levofloxacin (LEV)-linezolid(LNZ)-amikacin(AMK), b) LEV-LNZ-EMB, c) LEV-AMK-EMB; 4) to determine the antimicrobial and the synergistic activity of drug combinations of objective 3 against multidrug-resistant (MDR) and drug-susceptible clinical isolates of M. tuberculosis in a cell culture model of human macrophages from the THP-1 cell line.

In the study of murine macrophages, we found that INH-resistant and MDR isolates with mutations in the katG gene showed decreased multiplication inside murine macrophages, suggesting a lower fitness of M. tuberculosis with these resistance patterns. With the results of this thesis, the reliability of the method of the three-drug chequerboard assay has been showed. The combination including INH, RIF and EMB could be efficient to treat TB cases with low level INH resistance (MICs ≤ 0.8µg/ml) due to the synergistic effect of the combination showed. The combination including OFL, RIF and EMB shows better efficacy than that of INH, RIF and EMB, being of potential use in drug-susceptible and in INH-resistant isolates. The combinations including second-choice drugs (LEV-AMK-EMB; LEV-AMK-LNZ; LEV-EMB-LNZ) are equally effective to the combination of INH, RIF and EMB with the checkerboard assay. On the other hand, these drug combinations including second-choice drugs tested against M. tuberculosis-infected macrophages show antimicrobial activity, with the combinations including LNZ and LEV displaying an antagonistic effect.

La Tuberculosi (TB) continua sent una de les malalties més important en salut pública arreu del món. La preocupació sobre el control de la TB ha augmentat a conseqüència de l’aparició de soques resistents als fàrmacs disponibles actualment. Un millor coneixement de les soques de M. tuberculosis resistents a fàrmacs és clau per evitar la transmissió així com per dissenyar pautes de tractament més efectives contra la TB.

Els objectius d’aquesta tesi van ser: 1) analitzar l’habilitat de soques clíniques de M. tuberculosis resistents a fàrmacs de penetrar i créixer dintre dels macròfags murins comparat amb soques sensibles; 2) determinar l’activitat sinèrgica in vitro de les següents combinacions davant de soques clíniques de M. tuberculosis resistents a isoniazida (INH) comparant amb soques sensibles: a) INH-rifampicina(RIF)–etambutol (EMB) i b) ofloxacin (OFL)–RIF-EMB; 3) determinar l’activitat sinèrgica in vitro de les següents combinacions davant de soques clíniques de M. tuberculosis multiresistents comparant amb soques sensibles; a) levofloxacin(LEV)-linezolid(LNZ)-amikacin(AMK), b)LEV-LNZ-EMB, c)LEV-AMK-EMB; 4) determinar l’activitat microbiana i sinèrgica de les combinacions descrites al objectiu 3 davant de soques clíniques de M. tuberculosis multiresistents i sensibles en un model de macròfags humans de la línia cel•lular THP-1.

En l’estudi en macròfags murins, es va trobar que les soques resistents a INH i les multiresistents amb mutació en el gen katG van mostrar una multiplicació en l’interior dels macròfags disminuïda, suggerint una fitness disminuïda de les soques amb aquests patrons de resistència de M. tuberculosis. En aquesta tesi s’ha vist com l’adaptació del mètode de tauler d’escacs, és una tècnica fiable per l’estudi in vitro de combinacions de tres fàrmacs. La combinació incloent INH, RIF i EMB podria ser eficaç per tractar casos de TB amb una baixa resistència a INH (CIMs ≤ 0.8µg/ml) degut al efecte sinergístic de la combinació mostrat. Les combinacions de INH-RIF-EMB i la de OFL-EMB-RIF poden ser útils pel tractament tot i que la combinació que conté OFL presenta una eficàcia major, sent d’us potencial per tractar casos de soques resistents com de sensibles. In vitro, les combinacions que inclouen fàrmacs de segona línia (LEV-AMK-EMB; LEV-AMK-LNZ; LEV-EMB-LNZ) són igual de eficaces que la combinació de INH-RIF-EMB utilitzant el mètode de tauler d’escacs. En canvi, aquestes combinacions que inclouen fàrmacs de segona línia davant de macròfags humans THP-1 infectats amb M. tuberculosis mostren una activitat antimicrobiana, i un efecte antagonista de les combinacions que inclouen LEV i LNZ.