Sensors for in vitro bone tissue engineering applications

Abstract

This doctoral thesis explores how ion sensors can provide spatial and temporal control of specific cellular and biomaterial activity related to bone tissue engineering applications. First it was investigated the influence of different osteoblast-like cell models on the ionic extracellular environment (IEE) in vitro. Rat-derived mesenchymal stem cells (rMSCs) and SAOS-2 cells were observed to express high alkaline phosphatase (ALP) activity, and as a consequence they increased the concentration of inorganic phosphorus (Pi) in culture medium containing B-glycerophosphate. On the contrary, MG63 cells showed low ALP activity and did not influence [Pi]. Moreover, cell-induced calcium deposition in the extracellular matrix was observed both in mature SAOS-2 and rMSC layers but not in MG63 layers, and coincided with decreased [Ca2+] of the cell culture medium. Fluctuations in the IEE with respect to Pi and Ca2+ may therefore be indicative of specific osteoblast activity. Second, the ion reactivity of calcium-deficient hydroxyapatite (CDHA), a scaffold candidate material for bone TE, was systematically investigated in vitro by exposing it during different time periods to culture media of varying chemical composition. Traditional sorption models described experimental data well, revealing both significant sorption of Ca2+ onto CDHA and acidification of all culture media. Interestingly, different chemical composition of culture medium provoked opposite ion reactivity of CDHA with respect to Pi. Consequently, cellular sensitivity to dynamic IEEs may cause different cellular response using different culture media. Third, the effects of the dynamic IEE induced by CDHA on cellular behaviour were evaluated by growing SAOS-2 cells in semi-permeable inserts and in close proximity to CDHA. Cells proliferated well and their ALP-activity was modified mainly in time rather than in absolute levels. While cellular ALP-activity created conditions for Ca2+-deposition in the extracellular matrix in absence of CDHA, presence of CDHA caused competition between cells and material for Ca2+ and Pi which initially impeded cell-induced Ca2+-deposition. However, as sorption of Pi onto CDHA gradually decreased with time, conditions for bone mineralisation were created also in presence of CDHA. Obtained results indicate that sorption of Pi rather than sorption of Ca2+ was the main limiter for bone mineralisation in presence of CDHA.

Fluctuations in the IEE of bone TE applications awoke interest in developing a generic setup for potentiometric ion and pH measurements online. Traditional Ca2+-selective electrodes for measurements in small volumes (easily down to 0.1 mL) were fabricated. They exhibited a Nernstian response to Ca2+, and were little influenced by other major extracellular ions. Moreover, the electrodes resisted sterilisation through UV radiation, did not induce any cytotoxic effects in contact with osteoblasts, and the electrode potential was subject only to minor drift during longer measurements in cell culture medium. The electrodes were used to successfully monitor sorption of Ca2+ onto CDHA when immersed in culture medium, as well as osteoblast-induced Ca2+-deposition in mature extracellular matrix during time frames of 24 hours. Also, all-solid-state potentiometric microelectrodes based on iridium oxide were prepared for real-time monitoring of pH in traditionally inaccessible bone TE environments. Specifically, pH was measured inside curing bone cement (a-tri calcium phosphate) as well as at its immediate interface with extracellular fluid. In both cases the developed pH microelectrodes indicated how the material initially provoked an alkaline environment, which gradually acidified with time. Absolute pH variations caused by the material were of such magnitude that they should be considered upon drug loadings and/or implantation.

Esta tesis doctoral pretende explorar cómo los sensores iónicos permiten controlar a nivel espacial y temporal la actividad específica de células y biomateriales dentro del contexto de la bioingeniería del tejido óseo. En primer lugar, se investigó la influencia de diferentes modelos celulares de osteoblastos (osteoblast-like cells) cultivados in vitro en el ambiente iónico extracelular (ionic extracellular environment = IEE). Observamos que las células mesenquimales de rata (rMSCs = Rat-derived mesenchymal stem cells) y las células de tipo SAOS-2 expresan altos niveles de actividad fosfatasa alcalina (ALP = alkaline phosphatase), y en consecuencia, causan un incremento de la concentración de fósforo inorgánico (Pi) por hidrólisis del -glicerofosfato presente en el medio de cultivo. Por el contrario, las células MG63 mostraron baja actividad ALP y no modificaron la [Pi]. Es más, la deposición de calcio en la matriz extracelular inducida por las células se observó tanto en los cultivos maduros de células SAOS-2 y rMSC, pero no en las de tipo MG63, coincidiendo con una menor [Ca2+] en el medio de cultivo. Por lo tanto, las fluctuaciones de los iones Pi y Ca2+ en el IEE pueden ser posibles indicadores de la actividad mineralizadora de los osteoblastos. En segundo lugar, la reactividad iónica de la hidroxiapatita deficiente en calcio (CDHA = calcium-deficient hydroxyapatite) - un material candidato a ser utilizado como matriz en ingeniería del tejido óseo – fue investigada sistemáticamente in vitro exponiéndola durante diferentes periodos de tiempo a medios de cultivo con distinta composición química. Los modelos de sorción clásicos describen correctamente los datos experimentales, revelando procesos paralelos de sorción del ión Ca2+ en la CDHA y acidificación del medio. Cabe destacar que la distinta composición química del medio de cultivo puede provocar una reactividad iónica totalmente opuesta del CDHA respecto al anión Pi. En consecuencia, la sensibilidad celular a un entorno iónico dinámico puede dar lugar a respuestas celulares distintas al usar diferentes medios de cultivo. En tercer lugar, los efectos en el comportamiento celular provocados por la actividad de la CDHA en el entorno iónico dinámico se evaluaron realizando un cultivo de células SAOS-2 en un inserto semi-permeable colocado cercano pero separado de CDHA. Las células proliferaron bien y su actividad ALP sólo se alteró en el tiempo, pero no en términos absolutos. Mientras que, en ausencia de CDHA, la actividad ALP crea las condiciones para la deposición del ión Ca2+ en la matriz extracelular, presencia de CDHA causa competición entre las células y el biomaterial por los iones Ca2+ y Pi , que inicialmente bloquean la deposición celular de Ca2+. Sin embargo, a medida que la sorción del anión Pi disminuye con el tiempo, aparecen condiciones favorables para la mineralización incluso en presencia de CDHA. Los resultados obtenidos indican que la sorción de Pi más que la de Ca2+ es el principal factor limitante para la mineralización del hueso en presencia de CDHA. Las fluctuaciones del IEE en la bioingeniería del hueso han promovido un enorme interés en desarrollar un sistema genérico que permita monitorizar las medidas potenciométricas tanto de iones como del pH online. Fabricamos electrodos Ca2+-selectivos para medidas en volúmenes pequeños (hasta 0.1 mL). Dichos eléctrodos exhiben una respuesta Nernstiana al Ca2+, y son poco afectados por la presencia de los principales iones extracelulares. Asimismo, resisten la esterilización con UV, no presentan efectos citotóxicos en contacto con osteoblastos, y los potenciales presentan un “drift” despreciable en/durante medidas de gran duración en el medio de cultivo. Los electrodos se utilizaron con éxito para monitorizar la sorción de Ca2+ en CDHA dentro del medio de cultivo, así como la deposición de Ca2+ inducida por osteoblastos en la MEC madura, en intervalos de tiempo de hasta 24 horas.