Caracterització proteòmica i d'espermatozoides humans en pacients infèrtils i controls / Proteomic and molecular characterization of human spermatozoa in infertile patients and controls

Abstract

The knowledge of the proteins that are present in the spermatozoa is an essential step towards the comprehension of their normal function and their potential alterations associated to infertility. Although many studies have been performed in human male infertility, many of the causes still remain unknown, partly due to the fact that the proteins and the mechanisms involved in spermiogenesis and in sperm function are not known in detail. Therefore, the proteomic study of the human spermatozoa through mass spectrometry is relevant both, towards improving our fundamental knowledge and the mechanisms involved in the normal sperm physiology, as well as towards a better understanding of the male infertility. This doctoral thesis has contributed to the identification of the human sperm proteome through two-dimensional gels and mass spectrometry. Moreover, it has identified new correlations between the abundance of certain proteins and the seminal parameters related to male infertility such as the protamine content, DNA damage and sperm motility giving rise to the identification of potential diagnostic markers. In addition, the potential correlations between the protamine content and the presence of the protamine 2 precursors in the sperm cell from patients and the assisted reproductive outcomes have also been studied. Another point studied in the present thesis has been the determination, through immunofluorescent techniques, of the presence of nucleosomes and other proteins with a potential epigenetic function present in spermatozoon fractions selected through density gradients. Moreover, a protocol for the isolation of human sperm nuclei has been implemented to further identify, through mass spectrometry, minor nuclear proteins that may be important for normal sperm functioning or the embryo development.<br/><br/>KEYWORDS: Spermatozoon, Protamines, Proteome, Male infertility, Epigenetics

<I>El coneixement de les proteïnes que formen part de l'espermatozoide és un aspecte clau per comprendre el seu funcionament normal i les seves possibles alteracions associades a la infertilitat. Tot i la gran quantitat d'estudis sobre la infertilitat humana masculina, moltes de les seves causes es troben encara desconegudes degut, en part, a que les proteïnes i els mecanismes implicats en l'espermatogènesi i la funció de la cèl·lula espermàtica no es coneixen en detall. Per tant, l'estudi proteòmic de l'espermatozoide humà a través de l'espectrometria de masses és rellevant tant pel coneixement d'aspectes fonamentals com pel millor enteniment de la infertilitat masculina. Aquesta tesi doctoral ha contribuït a la identificació del proteoma de l'espermatozoide humà a través de gels bidimensionals i espectrometria de masses. Addicionalment s'han identificat relacions entre la abundància de certes proteïnes i paràmetres seminals relacionats amb la infertilitat masculina tals com el contingut de protamines, el dany al DNA o la motilitat dels espermatozoides donant lloc a la identificació de potencials marcadors diagnòstics. A més, s'han buscat les possibles correlacions entre el contingut de protamines i la presència de precursor de protamina 2 als espermatozoides de pacients amb els resultats de reproducció assistida. Un altre aspecte tractat ha estat la determinació, mitjançant tècniques immunofluorescents, de la presència de nucleosomes i altres proteïnes presents a fraccions d'espermatozoides seleccionades a través de gradients de densitat amb una funció potencial epigenètica. A més, s'ha implementat un protocol per aïllar nuclis d'espermatozoides humans per tal de poder identificar a través d'espectrometria de masses proteïnes nuclears minoritàries possiblement importants pel desenvolupament embrionari i el funcionament de l'espermatozoide no patològic.</i>

RESUMEN EN CASTELLANO:<br/><br/>El conocimiento de las proteínas que forman parte del espermatozoide es un aspecto clave para la comprensión de su funcionamiento normal i de sus posibles alteraciones asociadas a la infertilidad. A pesar de la gran cantidad de estudios sobre la infertilidad humana masculina, muchas de sus causas se encuentran aún desconocidas. Esto es debido, en parte, a que las proteínas y los mecanismos implicados en la espermatogénesis i la función de la célula espermática no se conocen en detalle. Por lo tanto, el estudio proteómico del espermatozoide humano a través de la espectrometría de masas es relevante tanto para el conocimiento de aspectos fundamentales como para el mejor entendimiento de la infertilidad masculina. Esta tesis doctoral ha contribuido en la identificación del proteoma del espermatozoide humano a través de geles bidimensionales i espectrometría de masas. Adicionalmente se han identificado relaciones entre la abundancia de ciertas proteínas i parámetros seminales relacionados con la infertilidad masculina tales como el contenido de protaminas, el daño en el DNA o la movilidad de los espermatozoides dando lugar a la identificación de potenciales marcadores diagnósticos. Además, se han buscado posibles correlaciones entre el contenido de protaminas i la presencia de precursor de protamina 2 en los espermatozoides de pacientes con los resultados de reproducción asistida. Otro aspecto tratado ha sido la determinación, mediante técnicas inmunofluorescentes, de la presencia de nucleosomas i otras proteínas presentes en fracciones de espermatozoides seleccionadas a través de gradientes de densidad con una función potencial epigenética. Además, se ha implementado un protocolo de aislamiento de núcleos de espermatozoides humanos con el objetivo de poder identificar a través de espectrometría de masas proteínas nucleares minoritarias posiblemente importantes para el desarrollo embrionario i el funcionamiento del espermatozoide no patológico. <br/><br/>PALABRAS CLAVE: Espermatozoide, Protaminas, Proteoma, Infertilidad masculina, Epigenética