Neurotoxicitat i metabolisme de nitrils a la rata i el ratolí

Abstract

Els nitrils són compostos químics que contenen el grup ciano: C N. Són molt abundants en la naturalesa, però la seva síntesi és també molt important pel gran ventall d'aplicacions que aquests aporten a la indústria. A la naturalesa els trobem, entre d'altres, en forma de glucòsids cianogènics com és el cas de l'amigdalina a les ametlles amargants i la linamarina a la mandioca, i en forma d'aminonitrils, forma que es troba a les lleguminoses del gènere Lathyrus. A la indústria s'utilitzen com a dissolvents i productes intermediaris en la síntesi de plàstics, fibres artificials, resines, productes farmacèutics i altres substàncies químiques. El consum humà o animal de determinats nitrils provoca símptomes similars a la intoxicació per cianur. Aquest fet suggereix que en la metabolització d'aquests nitrils es produeix l'alliberament d'aquest compost i que seria el responsable de la intoxicació aguda. Alguns nitrils però, en aquest procés de metabolització alliberen menys cianur o n'alliberen més lentament i aquests són els que provoquen neurotoxicitat i síndromes neurològiques. L'estudi d'aquest tipus de nitrils adquireix importància com a models de neurotoxicitat i de síndromes de toxicitat humanes causades per nitrils d'origen natural.<br/>A la primera part d'aquest treball de tesi s'ha pogut caracteritzar exhaustivament les dianes del 3,3'-iminodipropionitril (IDPN), l'al·lilnitril, el cis-crotononitril, el trans-crotononitril i el 2,4-hexadienenitril al sistema nerviós de la rata i establir la relació entre les lesions estructurals i els efectes comportamentals que aquests provoquen. Per a aquesta caracterització global, s'ha treballat amb un disseny experimental que combina experiments histopatològics amb tests d'avaluació comportamental animal. Els resultats han permès dividir els nitrils neurotòxics en dos grups, els que afecten al sistema nerviós central (trans-crotononitril i hexadienenitril) i els que afecten els sistemes sensorials (IDPN, al·lilnitril i cis-crotononitril).<br/>A la segona part de la tesi es demostra que la toxicitat vestibular de nitrils no és un fenomen exclusiu de la rata, sinó que ocorre també en altres espècies incloent-hi mamífers i no mamífers. Aquest resultats obren la porta a l'ús de soques de ratolins transgènics en l'estudi d'aquesta toxicitat.<br/>A la tercera part de la tesi s'estudia el paper de la metabolització d'aquests nitrils per a provocar els efectes neurotòxics. Concretament s'ha avaluat la bioactivació de la toxicitat vestibular del cis-crotononitril i l'al·lilnitril mitjançant el citocrom P450 2E1 utilitzant ratolins 129S1, ratolins transgènics pel citocrom P4502E1 i inhibidors selectius (Dial·lilsulfur) i no selectius (Aminobenzatriazol) d'aquest citocrom. A més, en aquesta segona part s'explica el procés d'optimització d'una metodologia que permet detectar simultàniament cianur i nitrils volàtils en sang, que combina la tècnica SPME (microextracció en fase sòlida) i la cromatografia de gasos amb detector NPD (detector nitrogen-fòsfor). Amb aquests treballs es demostra que tant l'al·lilnitril com el cis-crotononitril són substrats del citocrom P450 2E1 però que mitjançant aquest citocrom s'activa una via cianogènica no necessàriament vestibular. Els resultats obtinguts ens han permès concloure que la toxicitat vestibular d'aquets nitrils depèn d'un citocrom P450 diferent al 2E1 i que la via metabòlica amb efectes vestibulars més probable per a l'al·lilnitril és la de l'epoxidació del doble enllaç en posició beta-gamma.

<i>Los nitrilos son compuestos químicos que contienen el grupo ciano: -CN. Son muy abundantes en la naturaleza, pero su síntesis es también muy importante por el amplio rango de aplicaciones que estos aportan a la industria. En la naturaleza los encontramos en forma de glucósidos cianogénicos, como la amigdalina de las almendras amargas y la linamarina de la yuca, y en forma de aminonitrilos, forma que se encuentra en las leguminosas del género Lathyrus. En la industria se utilizan como disolventes i productos intermediarios en la síntesis de plásticos, fibras artificiales, resinas, productos farmacéuticos i otras sustancias químicas. El consumo humano o animal de determinados nitrilos provoca síntomas similares a la intoxicación por cianuro. Este hecho sugiere que en la metabolización de estos nitrilos se produce la liberación de este compuesto y que sería el responsable de la intoxicación aguda. Algunos nitrilos, en este proceso de metabolización, liberan menos cianuro o lo hacen de forma más lenta y estos son los que provocan neurotoxicidad y síndromes neurológicos. El estudio de estos nitrilos adquiere importancia como modelos de neurotoxicidad y síndromes neurológicos de toxicidad humana causados por nitrilos de origen natural.<br/>En la primera parte de este trabajo de tesis se ha podido caracterizar de forma exhaustiva las dianas del 3,3'-iminodipropionitrilo (IDPN), el alilnitrilo, el cis-crotononitrilo, el trans-crotononitrilo i el 2,4-hexadienenitrilo en el sistema nervioso central y establecer la relación entre las lesiones estructurales y los efectos comportamentales que estos provocan. Para esta caracterización global, se ha trabajado con un diseño experimental que combina experimentos hitopatológicos con tests de evaluación comportamental animal. Los resultados han permitido dividir los nitrilos neurotóxicos en dos grupos, los que afectan al sistema nervioso central (trans-crotononitrilo y hexadienenitrilo) y los que afectan a los sistemas sensoriales (IDPN, alilnitrilo y cis-crotononitrilo).<br/>En la segunda parte de la tesis se demuestra que la toxicidad vestibular de nitrilos no es un fenómeno exclusivo de la rata, sino que ocurre también en otras especies incluyendo mamíferos y no mamíferos. Estos resultados abren las puertas a la utilización de ratones transgénicos en el estudios de dicha toxicidad.<br/>En la tercera parte de la tesis se estudia el papel de la metabolización de estos nitrilos para provocar los efectos neurotóxicos. Concretamente se ha evaluado la bioactivación de la toxicidad vestibular del cis-crotononitrilo y el alilnitrilo mediante el citocromo P450 2E1 utilizando ratones 129S1, ratones transgénicos para el citocromo P450 2E1 y inhibidores selectivos (dialilsulfuro) y no selectivos (aminobenzatriazol) de este citocromo. Además, en esta tercera parte se explica el proceso de optimización de una metodología que permite detectar simultáneamente cianuro y nitrilos volátiles en sangre, que combina la técnica SPME (microextracción en fase sólida) y la cromatografía de gases con detector NPD (detector nitrógeno-fósforo). Con estos trabajos se demuestra que tanto el alilnitrilo como el cis-crotononitrilo son sustratos del citocromo P450 2E1 pero que mediante este citocromo se activa una vía cianogénica no necesariamente vestibular. Los resultados obtenidos nos han permitido concluir que la toxicidad vestibular de estos nitrilos depende de un citocromo P450 diferente al 2E1 y que la vía metabólica con efectos vestibulares más probable para el alilnitrilo es la epoxidación del doble enlace en posición beta-gamma. </I>

SUMMARY:<br/><br/>Nitriles are increasingly used in the chemical industry, and they are also common in crop plants. They cause acute lethality, osteolathyrism and neurotoxicity.<br/>In the first part of this thesis, we compared the behavioural effects of IDPN, allylnitrile, cis-crotononitrile, trans-crotononitrile, and hexadienenitrile in the rat using test methods sensitive to the ECC (Excitation with Choreiform and Circling movements) syndrome or to the trans-crotononitrile syndrome. In addition, we assessed the CNS effects of these nitriles with the Fluoro-Jade B stain, which selectively labels degenerating neurons. In conclusion, the present and previous data indicate that neurotoxic nitriles induce one of two syndromes of abnormal motor behaviour: (1) the ECC syndrome caused by IDPN, allylnitrile, and cis-crotononitrile, and resulting from degeneration of the vestibular sensory hair cells with no CNS toxicity role, and (2) the syndrome of faltering movements, caused by trans-crotononitrile and hexadienenitrile, and resulting from degeneration of the inferior olive neurons.<br/>In the second part of this thesis, we demonstrate that nitriles that are toxic to the vestibular and auditory systems of the rat are also ototoxic to other animal species, both mammals and no mammals. The findings open up the possibility of using species other than the rat to study this toxic effect of nitriles and the possibility of using nitriles for inner ear research performed in diverse animal species.<br/>In the third part of this thesis, we assessed the hypotheses that the vestibular or lethal toxicities of cis-crotononitrile and allylnitrile depend on CYP2E1-mediated bioactivation. Wild-type (129S1) and CYP2E1-null mice were exposed to cis-crotononitrile and allylnitrile in either a baseline condition or following exposure to 1% acetone in drinking water to induce CYP2E1 expression. In parallel groups, concentrations of cis-crotononitrile, allylnitrile and cyanide were assessed in whole blood using an optimized SPME GC-NPD methodology. Also further groups of animals were used to test the effect the non selective P450 inhibitor 1-aminobenzotriazole and the CYP2E1-selective inhibitor diallylsulfide on the toxicity of allylnitrile. We conclude that allylnitrile and cis-crotononitrile are CYP2E1 substrates and that CYP2E1-mediated metabolism of these nitriles leads to cyanide release and acute mortality, while a different P450 system bioactivates these nitriles for vestibular toxicity. We propose that CYP2E1 acts on allylnitrile by alfa-carbon hydroxylation and that an action on the beta-gamma-&#61472;double bound is more likely responsible for the vestibular effect.