Caracterització de la mort cel·lular en línies de neuroblastoma humà

Abstract

L'objectiu d'aquesta tesi ha estat buscar nous agents inductors de diferenciació, aturada del cicle cel·lular o mort cel·lular, per a les cèl·lules de neuroblastoma humà, més eficaços i més selectius que els fàrmacs utilitzats en la teràpia actual. Amb aquesta finalitat, hem estudiat l'efecte ex vivo en diferents línies cel·lulars de neuroblastoma humà de dos compostos, el pigment bacterià prodigiosina, i l'inhibidor general d'histona desacetilases de classe I/II tricostatina A. <br/><br/>La PG ha mostrat tenir un efecte citotòxic i citostàtic en les línies de neuroblastoma. Indueix mort cel·lular per mecanismes apoptòtics dependents de caspases, i especialment en les cèl·lules de neuroblastoma tipus N, les fenotípicament més agressives. No obstant la inhibició de l'activació de les caspases no reverteix complertament la mort cel·lular, indicant la implicació d'altres mecanismes de mort cel·lular en el procés desencadenat per PG. L'aturada de la proliferació cel·lular és en canvi molt més acusada en les cèl·lules tipus S, tot i que és un fenomen observat en totes les cèl·lules estudiades. A més a més, en el present treball hem descrit com la PG, després de la seva entrada per difusió en la cèl·lula, s'acumula especialment en els mitocondris, induint un efecte desacoblant entre la cadena respiratòria i l'activitat de l'ATPasa-F0-F1 mitocondrial de les cèl·lules de neuroblastoma. Com a resultat, la producció d'ATP es veu disminuïda notablement però la taxa de consum d'oxigen no s'altera. Nosaltres suggerim que l'explicació a aquest fet podria trobar-se en l'habilitat que té la PG per a atrapar protons a pH fisiològic, modificant així els gradients de pH intracel·lulars, no tant sols els vesiculars i els lisosomals, si no també molt possiblement els intramitocondrials. <br/><br/>Al capítol dos es descriuen els resultats de l'estudi del tractament de les cèl·lules de neuroblastoma amb TSA. El TSA indueix una aturada del cicle cel·lular en G2/M i apoptosi, però també autofàgia, procés fins al moment no descrit en aquestes cèl·lules com a resposta a l'exposició a HDIs, no havent-se observat diferències en aquests efectes entre les cèl·lules neuroblàstiques tipus N, S i I. En concordança amb estudis previs, la disminució de la proliferació i l'aturada en G2/M ha resultat ser conseqüència d'un procés independent de les caspases. Probablement associat a l'augment d'expressió de l'inhibidor de CDKs p21WAF/Cip1 i a l'activació de la via supressora de tumors del RB, tal i com suggereix la disminució de l'expressió de N-Myc, E2F-1 i Survivina, tots ells implicats en aquesta via, i a més a més marcadors de mal pronòstic en el neuroblastoma. Podent ser la disminució de la Survivina responsable per si sola del desencadenament de l'apoptosi. No obstant, l'efecte del TSA no ha estat el mateix en totes les línies cel·lulars de neuroblastoma estudiades, sent les cèl·lules SK-N-AS les més resistents. En aquestes cèl·lules, tot i activar-se els mateixos mecanismes que en la resta de cèl·lules estudiades, la disminució de la viabilitat és molt reduïda i, a les dosis utilitzades, sembla prevaldre un efecte citostàtic. És més, mentre en les cèl·lules LA1-55N, SK-N-JD i LA1-5S, apoptosi i autofàgia semblen estar induint-se simultàniament i col·laborar en la mort cel·lular induïda pel TSA, en les SK-N-AS els resultats suggereixen que aquests dos mecanismes tenen finalitats antagòniques, de manera que l'autofàgia promou la supervivència cel·lular. <br/><br/>Així doncs, els resultats obtinguts indiquen que els dos compostos són capaços d'induir una disminució de la viabilitat cel·lular deguda a una aturada de la proliferació i/o a la mort cel·lular. A més a més, els resultats de l'exposició de les cèl·lules als dos compostos són prou diferents als produïts pels anticancerígens convencionals, com per considerar-se el seu assaig en diferents combinacions amb altres quimioteràpics.

<I>"Characterization of cell death in human neuroblastoma cell lines."<br/><br/>TEXT:<br/><br/>The objective of this thesis was to look for new agents capable to induce differentiation, cell cycle arrest or cell death in neuroblastoma human cells, more efficient and selective than the ones use in actual therapy. With this purpose, we have studied the ex vivo effect of two compounds in different human neuroblastoma cell lines, the red pigment prodigiosin, and trichostatin A, a general inhibitor of histone deacetylases of class I/II. <br/>Prodigiosin showed a cytotoxic and cytostatic effect in neuroblastoma cells. It induced cell death through caspase-dependent apoptotic mechanisms, especially in N-type neuroblastoma cells, the more aggressive ones. We suggest this effect could be explained by prodigiosin ability to capture protons at physiologic pH, modifying the intracellular pH gradients.<br/>At the second chapter we described the effect of trichostatin A in this cell model. Trichostatin-A induces a G2/M-cycle arrest, apoptosis and authopagy in the three types of neuroblastoma cells, N-, I- and S-type. However, not all the cells exhibited the same sensibility, being the SK-N-AS cells the more resistant to this compound. Moreover, while in LA1-55N, SK-N-JD and LA1-5S cells apoptosis and autophagy seem to be induced simultaneously and to collaborate in TSA-induced cell death, in SK-N-AS cells these two mechanisms seem to have antagonic purposes, leading autophagy to cell survival.<br/>In conclusion, the results indicate that these two agents are able to induce a decrease in cell viability because of cell-cycle arrest and/or cell death. Furthermore, the consequences of the exposition of the cells to these compounds are different enough to the obtained by conventional therapy, to consider its assay with different combinations of other chemotherapy agents. </I>