Anàlisi del contingut de RNA i estudi mutacional de gens candidats en iinfertilitat masculina

Abstract

La infertilitat és un problema que cada cop és més comú en la població actual. S’ha definit que la meitat dels casos de la infertilitat es deu a un factor masculí, no obstant, la gran majoria segueix sent d’etiologia desconeguda. Els grans objectius d’aquesta tesi es poden dividir en dos camps: (i) la cerca de factors genètics que puguin ser causa de la infertilitat masculina i (ii) la cerca de nous factors, com els RNAs i miRNAs, que puguin aclarir la patogenicitat de tipus determinats de infertilitat i el seu futur ús com a biomarcadors de la fertilitat. Vam utilitzar tres estratègies per identificar possibles gens candidats pel seu estudi mutacional: transcriptòmica diferencial, proteòmica diferencial i recerca bibliogràfica dels seus corresponents ratolins genoanul•lats. Els gens seleccionats van ser: (i) Protamina 1 (PRM1) i Protamina 2 (PRM2) (ii) Heat schock protein 2 (HSPA2) (iii) Subunitat 1 de la prohibitina (PHB1), (iv) Bromodomain testis specific (BRDT), (v) Bromodomain containing 2 (BRD2). Podem dividir els gens candidats seleccionats en dos tipus: (i) Gens candidats que la seva deleció en animals únicament comporten fallides en la fertilitat (PRM1, PRM2, HSPA2 i BRDT) i (ii) gens que els seus genoanul•lats presenten mort embrionària (PHB1 i BRD2). Els nostres resultats dels estudis mutacionals realitzats ens mostren que l’existència de variants potencialment patogèniques i d’alta penetrància són una causa infreqüent de la infertilitat masculina. Els nostres resultats van en concordança amb els resultats del primer estudi genome-wide en pacients azoospèrmics i oligozoospèrmics severs. Per tant, podem concloure que la infertilitat masculina possiblement sigui similar a la majoria de malalties complexes, degudes a un problema multigènic/multifactorial, on cap SNP sembla ser responsable d’una proporció considerable de casos d’infertilitat masculina idiopàtica. Per tant, cada variant rara que s’ha descrit pot tenir un petit efecte en el fenotip, però és el conjunt possiblement unit a l’ambient el que resulta en la infertilitat. Per tant, es necessita de més estudis en un nombre molt mes gran de individus, possiblement fent servir una estratègia de seqüenciació completa del genoma, per determinar els backgrounds genètics, possibles interaccions o efecte additiu entre variants i així començar a identificar les combinacions de factors responsables de la infertilitat masculina. Per altra banda tot i que l’avaluació dels paràmetres seminals és útil en el diagnosis de la infertilitat masculina té importants limitacions ja que no sempre bons paràmetres seminals són indicatius de un bon potencial de fertilitat. Per tant és necessari trobar marcadors addicionals que ens donin informació del potencial de fertilització de l’espermatozoide. S’ha descrit que l’espermatozoide humà madur conté RNA . Essencialment, hi ha dues hipòtesis que explicarien la presència de RNA en l’espermatozoide. Una és que podrien tenir una funció en la expressió de gens durant la embriogènesis primerenca. L’altra és que aquests RNA poden ser romanents de l’espermatogènesi però tot i aixo podrien ser útils com a marcadors de l’estat de fertilitat i per avaluar els esdeveniments passats que han ocorregut durant l’espermatogènesi. En aquest treball hem detectat en pacients astenozoospèrmics diversos RNAs amb una abundància alterada. Aquests resultats ens ofereixen la possibilitat d’aprofundir en l’ estudi dels mecanismes patogènics que poden actuar en l’astenozoospèrmia, com també en el plantejament de la futura utilització d’aquests RNAs alterats que hem detectat com a possibles futurs biomarcadors de la fertilitat, per tal d’aconseguir una millor caracterització dels pacients infèrtils. A més a més, els resultats ens mostren nous gens candidats per al seu estudi mutacional, amb la finalitat de cercar mutacions que ens puguin explicar les possibles alteracions en la seva transcripció, com en el cas de BRD2. En aquest treball també hem descrit un pool de miRNAs estables en els espermatozoides madurs de diferents mostres, el que ens fa pensar que aquests poden tenir una funció en els primers passos del desenvolupament embrionari o bé també ens poden explicar fets passats durant l’espermatogènesi. Per tant tenim tot un ampli camp a explorar per veure si alteracions en certs miRNAs poden estar associats a la infertilitat masculina.

There is some evidence that a significant proportion of idiopathic male infertility is due to recessive inheritance. Linkage analysis is applied in most hereditary diseases however are not appropriate in the case of infertility, because there are only one or few members’ affections in families studied. The alternative is performing mutational studies of candidate genes or genetic association studies using cases (infertile patients) and controls (fertile men). We had used three different strategies in order to identify candidate genes and therefore genetic factors associated with male infertility (comparative proteomics analysis, comparative transcriptomics analysis and bibliographic research of animal models infertile). We performed mutation analyses of 6 genes: PRM1, PRM2, HSPA2, PHB1, BRDT and BRD2 gene in different types of infertile patients. Our results in accordance with the first genome-wide study suggest that no pathogenic high penetrance mutations cause male infertility. The evaluation of seminal parameters is useful in the diagnosis of male infertility. However these parameters have important limitations since not always good seminal parameters are indicative of a good fertilization potential. Therefore there is a need for additional markers useful in the assessment of the sperm fertility potential. It is well known, that the mature human sperm cell contains RNA. Independently of the functions of the sperm RNA, the differences in RNA amounts between infertile patients and controls provide a means to assess the fidelity of past events of spermatogenesis. Therefore the analysis of the sperm RNA has the potential to be used as a marker to assess the fertility status. Our results identified several differential transcripts present in athenozoozospermic patients as compared to controls. These results open up the possibility to investigate the implication of these genes in the pathogenic mechanisms in asthenozoospermia and to consider their potential utility as infertility biomarkers.