Caracterización molecular de nuevos substratos de la CDK Pho85

Abstract

La ciclina Cln3 es un activador crítico de START, cuya sobreexpresión provoca células de menor tamaño que progresan rápidamente por el ciclo celular, mientras que su deleción induce un mayor tamaño de las células y retrasa el ciclo de éstas (Cross 1988, Nash et al. 1988), actualmente se cuenta con numerosa información acerca del importante papel de Cln3 en la regulación de START, unida a la CDK Cdc28. (Wang et al. 2009). Estudios previos realizados en este grupo han descrito una nueva relación molecular que ha permitido darle un enfoque novedoso a la función de Cln3: se ha observado que una deficiencia de fosfatos en el medio, modifica la estabilidad de Cln3 e induce una parada en la fase G1 del ciclo celular. Esta disminución, también se observó en aquellas cepas donde Pho85, uno de los principales reguladores del metabolismo del fosfato, tenía inhibida su actividad quinasa (Menoyo et al. 2013). Pho85 es una CDK multifuncional, que presenta una elevada promiscuidad molecular, ya que es dirigida a un gran número de substratos mediante la unión a 10 ciclinas diferentes. Cln3 podría ser uno de estos substratos ya que resultados previos indican una clara interacción génica entre Cln3 y el complejo Pho85-Pho80 (Menoyo et al. 2013). Pero las evidencias moleculares que demuestran si esta interacción es directa, necesarias para considerar a Cln3 un substrato bona fide de Pho85, aún debían ser caracterizadas. En este trabajo doctoral, se demuestra que Pho85 unido a Pho80 está fosforilando in vitro a Cln3 y mediante experimentos in vitro, se observa que esta fosforilación incrementa la vida media de la proteína. Además, también se ha podido observar la fosforilación in vivo así como el efecto que el mutante no fosforilable de Cln3 ejerce sobre el ciclo celular.

Cln3 es un substrato compartido por las CDK’s Cdc28 y Pho85. El rol de las CDKs de S. cerevisiae está muy bien caracterizado, siendo Cdc28 asociada a sus ciclinas, esencial en la regulación del ciclo celular. Por otra parte, Pho85 asociado a ciclinas de G1 actúa regulando el ciclo (Measday et al. 1994) y aunque no es esencial para la viabilidad celular, aquellas células que no disponen de este gen tienen múltiples problemas: desde morfología anormal hasta retraso en el ciclo celular, pasando también por una acumulación de glucógeno (Carroll, O'Shea 2002) y sensibilidad a diversos componentes químicos (Huang et al. 2002). Por esta razón, mientras que Cdc28 es conocida como la CDK esencial de S. cerevisiae, Pho85 lo es como la CDK multifuncional que controla diferentes vías moleculares de este organismo. La definición no es errónea, ya que Pho85-Pcl1 comparte un gran número de substratos con Cdc28: Sic1 es fosforilado por ambas quinasas para ser destruido (Nishizawa et al. 1998), ocurre lo mismo con Clb6 (Jackson et al. 2006), mientras que en el caso de Bni4 (Zou et al. 2009, Holt et al. 2009) la fosforilación garantiza su correcta localización. Parte de los experimentos de esta tesis, se han centrado en encontrar nuevos substratos que únicamente estén siendo afectados por los complejos de Pho85-Pcl1, para así poder averiguar las funciones específicas de esta quinasa en la fase G1 del ciclo celular. Mediante experimentos de proteómica se buscaron interacciones con este complejo y finalmente se caracterizó la relación molecular de uno de ellos: la E3 ligasa Dma1. Debido a la gran cantidad y a las diferentes clases de E3 que existen en todos los organismos, las ubiquitin ligasas son de los factores implicados en la cascada de ubiquitinación, que más se desconoce. En células humanas, las ubiquitin ligasas están implicadas en un gran número de patologías, lo cual las vuelve idóneas para ser utilizadas como dianas terapéuticas. A medida que avanzan las investigaciones, se descubre que la complejidad del sistema de ubiquitinación es cada vez mayor y el número de preguntas relacionadas con este tipo de enzimas, aumentan día a día. En las investigaciones presentadas, se observa que Pho85 unido a Pcl1 fosforila a Dma1 en unos residuos concretos, ubicados en el extremo N-terminal de la proteína. Esta fosforilación modifica la actividad ubiquitinadora de Dma1, reduciéndola, lo cual podría tener relevancia en el control de la cantidad de Dma1 en determinadas circunstancias.