Metabolisme de poliamines en Arabidopsis i implicació en la resposta a l’estrès

Abstract

Les poliamines més comunes són putrescina, espermidina i espermina. En vegetals, els nivells d’aquests compostos incrementen en resposta a diferents tipus d'estrès ambiental. Tanmateix, es desconeix el significat fisiològic d’aquest augment. En general, s'ha atribuït un paper protector a espermidina i espermina, mentre que, en molts casos, la putrescina es considera només com a precursor de les altres dues poliamines. En la planta model Arabidopsis thaliana la putrescina es forma per descarboxilació d’arginina, mediada per arginina descarboxilas (ADC), que es codificada per dos gens: ADC1 i ADC2. En la present Tesis Doctoral, s’ha estudiat la resposta a l’estrès per fred i per sequera de plantes transgèniques d’Arabidopsis sobreexpressores dels gen homòlegs ADC1 i ADC2. Aquestes plantes tenen augmentats els nivells de putrescina, però no els d’espermidina ni d’espermina. Els resultats obtinguts mostren que les plantes que acumulen Put, per sobreexpressió d’ADC1 o ADC2, són més resistents a fred, sobretot si es tracta de plantes aclimatades prèviament. D’altra banda, la tolerància a deshidratació només s’ha observat en aquelles plantes que acumulen grans quantitats de Put via ADC2, i el grau de tolerància es proporcional als nivells de putrescina. Les plantes sobreexpresores d’ADC2 mostren una reducció en la taxa de transpiració i en la conductància estomàtica, i son més sensibles a ABA, encara que no s’han trobat diferencies en els nivells d’aquesta a l’hormona. Aquests resultats suggereixen que un dels mecanismes implicats en la resistència a sequera d’aquestes plantes, és la reducció de la pèrdua d’aigua per transpiració com a resultat d’una menor obertura estomàtica induïda per un augment en la resposta a ABA. Les diferencies entre els plantes sobreexpresores d’ADC1 i ADC2 podrien venir donades per una diferent localització de les corresponents proteïnes, ja que s’ha observat que ADC1 es troba al nucli, mentre que ADC2 es localitza als cloroplasts. En conjunt els resultats obtinguts demostren que la putrescina te un paper intrínsec en la resposta de les plantes a estrès. Els nivells de poliamines estan regulats també pel catabolisme. Les poliamines són degradades per desaminació oxidativa mediada per aminoxidases, que poden ser dependents de FAD (PAOs) o de coure (CuAOs). Clàssicament s’ha considerat que les amino oxidases tenen una localització apoplàstica. En Arabidopsis s’han descrit cinc isoformes de PAOs , tres s’han localitzat en peroxisomes, i les altres dues tenen una predicció de localització citoplasmàtica. Cap d’aquestes proteïnes du a terme l’oxidació terminal de PAs, si no que catalitzen una ruta de retroconversió, produint espermidina a partir d’espermina, i putrescina a partir d’espermina. Tot això fa pensar en com s’oxiden les PAs en l’apoplast d’Arabidopsis i si en els peroxisomes s’hi du a terme l’oxidació terminal. A. thaliana té 10 gens descrits com a CuAOs, però fins al moment només un (ATAO1) s’ha caracteritzat a nivell funcional. En aquesta tesis s’han caracteritzat a nivell funcional tres CuAOs d’Arabidopsis (AtCuAO1-3) que catalitzen l’oxidació terminal de l’espermidina i la putrescina. AtCuAO1, com l’ATAO1, és una proteïna extracel•lular, el que suggereix que el catabolismes de les PAs en l’apoplast d’Arabidopsis és mediat per CuAOs. AtCuAO2 i AtCuAO3 es troben en els peroxisomes, el que indica que el catabolisme terminal i la retroconversió funcionen de manera coordinada per mantenir la homeòstasi de poliamines, ja que l’acumulació de Put inhibeix les PAOs. El perfil d’expressió de les tres AtCuAOs en resposta a diferents estímuls exteriors suggereix una especificació funcional d’aquestes proteïnes enfront diferents tipus d’estrès. En aquesta tesis doctoral s’aporten, per primera vegada, evidencies sobre la integració de les dos rutes de oxidació de les poliamines que fins ara s’havien estudiat de manera independent.

In plants, polyamine (putrescine, spermidine, spermine) levels increase in response to different abiotic stresses, but the biological meaning of this increase remains unclear. A protective role has been attributed to spermidine and spermine, while, in most cases, putrescine is considered only as a precursor of the other polyamines. In Arabidopsis, ADC (Arginine decarboxylase), the first enzyme involved in polyamine biosynthesis is encoded by two genes (ADC1 and ADC2).In this work, we have undertaken a genetic approach to study the effect of ADC1 and ADC2 over-expression in Arabidopsis freezing and drought tolerance. The obtained transgenic lines contain high putrescine levels and no increase in spermidine and spermine. Accumulation of putrescine by ADC1 or ADC2 over-expression is sufficient to promote freezing tolerance, mainly in cold-acclimated plants. Hower, only lines that accumulate Put by ADC2 over-expression are drought tolerant, and the degree of resistance correlates with Put content.This phenotype is related with a reduction in transpiration rate and stomata conductance, as well as an increased ABA-sensitivity. The differences between ADC1 and ADC2 over-expressing plants can be due to a different protein cellular localization. Polyamine levels are also regulated by degradation, mediated by FAD- and copper-dependent amine oxidases (PAOs and CuAOs). In Arabidospsis, five PAO isoforms, which oxidize polyamines by a back-conversion pathway, producing spermine and spermidine from putrescine have been characterized. However, only one of the ten gens annotated as CuAOs has been characterized so far. In this work, three CuAOs (AtCuAO1-3), involved in the terminal polyamine catabolism in Arabidopsis, have been functionally characterized. The results indicate a differential localization of AtCuAOs in the apoplast and peroxisomes together with a possible functional specification of AtCuAOs against different types of stress. Importantly, our results show that back-conversion and terminal catabolism work co-ordinately in peroxisomes to maintain polyamine homeostasis. For the first time we provide evidences for the integration of oxidative polyamine pathways that have so far studied in isolation.